《CR原理及应用》PPT课件

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1、聚合酶链式反应PolymeraseChainReactionRTPPCAU聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，它可将极微量的靶DNA在数小时内特异地扩增上百万倍。RTPPCAU70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每

2、次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。RTPPCAU1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。RTPPCAUPCR基本原理PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denaturation):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)

3、退火(Annealing):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。RTPPCAURTPPCAUPCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用C＝C0(1+P)n计算。C代表DNA片段扩增后的拷贝数，C0表示扩增开始时DNA模板数，P表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平

4、均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。PCR的反应动力学RTPPCAU反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”这种效应称平台期，平台期受PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素的影响。RTPPCAUPCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样

5、而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。PCR扩增产物RTPPCAU进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，

6、几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。RTPPCAUPCR反应的特点①引物与模板DNA特异正确的结合②碱基配对原则③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性④靶基因的特异性与保守性。RTPPCAU——灵敏度高PCR反应特点PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。RTPPCA

7、UPCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。PCR反应特点——简单、快速RTPPCAU不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCR反应特点—对标本的纯度要求低RTPPCAUPCR反应体系优化PCR反应体系引物dNTPMg2+Taq聚合酶模板反应缓冲液RTPPCAU引物设计的3条基本原则：引物与模

8、板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。PCR反应体系—引物RTPPCAU引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Ta