《CR的技术原理》PPT课件

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1、基因工程商丘师范学院马原松mysong987@163.com13603702507第五章PCR的技术原理第五章PCR的技术原理教学目的和要求:通过本章的学习，要求学生了解利用PCR技术原理所衍生出来的技术方法的种类和工作原理，达到能够自觉合理地利用PCR技术为科研服务，PCR鉴定和诊断；理解PCR介导的克隆和PCR介导的诱变；掌握PCR技术的基本原理、基本操作程序，引物设计方法。重点、难点：PCR技术的基本原理；引物设计方法；PCR介导的克隆。教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等本章思考题：1.简述P

2、CR反应的工作原理。2.循环次数是否越多越好？为何？3.进行PCR引物设计时应注意哪些原则?4.进行PCR产物克隆的方法主要有哪些？主要参考资料:1.吴乃虎主编.基因工程原理(第二版).北京:科学出版社,2002.2.J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南(第三版).北京:科学出版社,2002.3.F.奥斯伯等著.精编分子生物学实验指南.北京:科学出版社,2005.4.[美]本杰明∙卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007.5.何光源主编.植物基因工程实验手册.北京:清华大学出版社,2007第一节PCR

3、技术原理和工作方式1983年，由Cetus公司的KaryMullis建立；1988年耐热的TaqDNA聚合酶被发现和应用，把PCR推向了实用阶段，成为PCR发展史上又一里程碑；1989年，美国专利局授予PCR技术专利；1989年，PCR技术被《science》杂志评选为伟大的技术发明；1989年为DNA聚合酶的分子年；1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖。计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程序，使之迅速得到推广。PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的一个里程碑，巨

4、大的推动作用。一、PCR的基本原理1、PCR的基本原理PCR(多聚酶链式反应)是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大

5、量（106倍）的介于两个引物之间的特异DNA片段。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。一、PCR的基本原理1、PCR的基本原理变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。变性因素：加热、酸、碱、紫外线等。一、PCR的基本原理1、PCR的基本原理Tm(meltingtemperature)：50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。一般生理条件下，Tm在85℃-95℃之间。影响Tm值的因素：（G+C）含量

6、增加，Tm值增高溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）；甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活）；若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内.Tm值的计算：Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=4(G+C)+2(A+T)（<20bp）一、PCR的基本原理1、PCR的基本原理复性(renaturation)：变性的两条DNA单链在合适的条件下，又可按原来的碱基配对，再结合在一起形成双螺旋构象，又称退火。复性速度与温度

7、有关，当温度缓慢下降才使其重新配对复性；若将其迅速冷却至4℃以下，则几乎不能发生复性（可用来保持DNA的变性状态）。复性的最佳温度为：Tm-5℃。DNA的序列：简单的—复性快；DNA的浓度：高—复性快（分子多、碰撞机会多）；DNA片段的大小：大—复性慢（分子大、运动慢）；溶液的离子强度：高—复性快（中和DNA分子上的负电荷，减少两条单链的同性相斥性）；DNA部分复性，复性的速度非常快。一、PCR的基本原理2、PCR扩增步骤：①DNA模板的解链（变性）90℃~95℃，30s理论上，在90℃左右能使DNA双

8、链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。②DNA单链与引物的退火（复性）55℃~65℃，30~45s引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率>>DNA自身复性几率）;引物的最佳退火温度Tm-5℃，引物的量、引物的长度。一、PCR的基本原理2、PCR扩增步骤：③引物的延伸（新链DNA的合成）70~75℃