CR技术的原理、操作及应用

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1、PCR技术的原理、操作及应用湖南省疾病预防控制中心微生物检验科黄一伟什么是PCRPCR:Polymerasechainreaction，即聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的发展历史关于PCR的文章首次由美国科学家KaryMullis等人在《Science》杂志上发表《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993KaryMul

2、lis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的原理1遗传物质：细胞核染色体DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。PCR技术的原理2PCR反应的基本成分包括7种基本成分：模板DNA

3、、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子基本反应步骤：变性--退火--延伸最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出PCR技术的原理31234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍RT-PCR的原理相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNAcDNA合成，是单链到双链的过程。实时荧光定量PCR的原理1实时荧光定量PCR技术(

4、Real-TimeQuantitativePCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光定量PCR试剂：SYBRGreenITaqman水解探针实时荧光定量PCR的原理2基线（Baseline）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。光阈值threshold的设定一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指

5、数期。CT(Cyclethreshold)值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR的原理3Ct与初始模板的关系固定循环数后，荧光信号与模板数成正比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线

6、性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量阈值104103102PCR技术的优点优点:特异敏感快速、简便易自动化等PCR技术的局限性为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。PCR技术扩增产物的长度有限。PCR技术的注意事项防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。引物设计合理Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/2

7、0个循环镁离子浓度对反应效率的影响仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等RT-PCR注意防止RNA降解PCR技术的操作1以流感病毒的RT-PCR和Real-timeRT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤主要仪器：PCR仪，Real-timePCR仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。PCR技术的操作21.病毒核酸RNA提取2.RT-PCR反应或者Real-timeRT-PCR反应3.UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果流感病毒核酸提取1试验材料QIAGEN公司的RneasyMiniK

8、it(或QIAGEN公司的QIAmpViralRNAMiniKit，操作类似)β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）70%乙醇无菌及DNA,RNA酶的1.5ml离心管10μl、20