家蚕微孢子虫cDNA文库的构建、EST数据分析及应用研究

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1、西南农业大学硕士学位论文家蚕微孢子虫cDNA文库的构建、EST数据分析及应用研究姓名：刘加彬申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：周泽扬;夏庆友2003.5.1摘要微孢子虫是一类广泛存在的，无线粒体的单细胞原生动物寄生虫。微孢子虫能感染寄生脊椎动物和无脊椎动物，是经济昆虫、鱼类、兔类、皮毛动物、啮齿类及灵长类动物的致命病原。对于感染爱滋病病毒或者先天免疫机能不健全的病人来说，则是一个典型的机会性病原物，它能加剧病人痛苦，加速病人死亡。因此展开对有关微孢子虫的研究对于稳定生产、卫生防疫和环境生态诸方面都有着重要意义。

2、养蚕业作为我国的传统产业，在农业上一直占有重要的经济地位。而由家蚕微孢子虫(Nosema．bombycisNbJ引起的家蚕微粒子病则是养蚕业的毁灭性病害。由于家蚕微粒子能经卵传染危害家蚕子代而被列为蚕种生产的唯一检疫对象，因此这一领域一直是蚕病学的研究重点。4和热点。凇研究以家蚕微孢子虫为实验材料，以^TriplEx2为载体，构建了家蚕微孢子虫cDNA文库。通过随机挑选部分克隆进行EST测序后。进行网上同源性比较和基因功能分析，得出以下结论：一、微孢子虫^cbomb罗ciscDNA文库的构建，采用Percoll法对感染家蚕的微

3、孢子虫^[bombycis进行纯化，得到均一性和折光性一致，无组织碎片和杂菌、纯度高的微孢子虫．然后用TRIZOL试剂盒提取家蚕微孢子虫的总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示提取的家蚕微孢子虫RNA的23S、16S、5S核带较为清晰。说明所精制的mRNA受分解的程度小。经紫外分光光度计测定。RNA纯度较高，能够满足实验的需要。用SMARTIVOligonucleotide和CDSⅢ／3’PCRPrime为引物，在PowerSciptReverseTranscriptase酶的作用下合成第一链cDNA并进一步合成第二链eDNA,

4、经蛋白酶K消化和sfi酶切后用CHROMASPIN-400column柱进行分级分离以去除小于400bp的cDNA片段和一些核糖RNA，回收后按比例与载体^TriplEx2(带有sfi酶切末端)连接和包装，获得eDNA文库。包装产物中加500ulsM、20u1氯仿和终浓度为7％的D幅o，分装后置一70℃保存。?广7二、文库质量的鉴定f7将得到的cDNA文库按一定的比例进行稀释，将文库的稀释液与BM25．8筛选菌株的感受态细胞混匀，加入0．6％的顶层培养基．铺平板并在37℃下培养．经计算得到该文库的滴度为1．86X106：根据载

5、体的多克隆位点。用EcoRI和Hindm进行双酶切，得出该文库的外源插入片段平均都在500bp以上。．，h7三、EST测序f从cDNA文库中随机挑选部分克隆，经EcoRI、HindIII双酶切鉴定．进行1％琼脂塘凝胶电泳结果显示，大部分克隆都有外源片段的插入。本实验共测了180个阳性克隆，用T3引物从5’端测序，得到130个有效序列，测序成功率为72．2％．测出的ESTs平均长度为552bp。＼+一’。四、测序结果分析／对130个有效序列在NCBI的Genebank里进行比对，经BLASTN、X同源性分析后发现，其中有96冷为

6、核糖体编码序列．另有7个ESTs在氨基酸水平上与脑孢虫编码序列有较高的同源性，它们分别编码的是组蛋白H4、DnaJ蛋白(hsp40)、遍在蛋白复合体、突触融合蛋白类似物、锌指蛋白、解旋酶MOTl以及ADP／ATPCarrierProtein，但它们在核苷酸水平上同源性较低。与此同时获得了27个未知功能基因。j。五、家蚕微孢子虫ADP／ATPCarrierProtein基因的扩增及结构分析／ADP／ATPCarrierProtein是一种-q微孢子发育、繁殖密切相关的功能蛋白，这种基因编码微孢手虫在寄生过程中从宿主摄取能量过程中

7、起关键作用的酶类。根据已有的EST序列设计引物，在家蚕微孢子虫基因组中扩增到了该基因的部分序列，从而为该基因的进一步研究提供了科学依据．通过Clostalw软件分析后发现，编码ADPIATPCarrierProtein基因在已有的部分序列中不存在内含子区域。由于家蚕微孢子虫是比较低等的原生动物，其内含子序列的多寡及有无有待深入研究．、。7六、ADP／ATPCarrierProtein基因序列用于RN^i的探讨／将编码功能蛋白ADP／ATPCarrierProtein的克隆用RNA合成系统制备成外源性双链RN^，当孢子l虫在Bm

8、N细胞中大致发育到裂殖体时期时，用DOTAP转染系统将外源性双链P,NA导入到宿主细胞中，经随机抽样统计，结果初步表明。外源性双链RNA的存在对平均每个细胞感染微孢子虫个数存在～定的差异，但未达到显著水平。这可能是由于家蚕微孢子虫与脑孢虫一样，存在多个基因参与能量的运输，或者