感染家蚕微孢子虫蚕卵检测靶标的研究

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1、重庆师范大学硕士学位论文感染家蚕微孢子虫蚕卵检测靶标的研究硕士研究生：龚娟娟指导教师：王林玲副教授周泽扬教授学科专业：动物学所在学院：生命科学学院重庆师范大学二零一四年四月1万方数据AThesisSubmittedtoChongqingNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterStudyonDetectiveTargetsforSilkwormEggsInfectedbyNosemaBombycisCan

2、didate：GongJuanjuanSupervisor：WangLinlingAssociateProfessorZhouZeyangProfessorMajor：ZoologyCollege：CollegeofLifeSciencesChongqingNormalUniversityApril，20142万方数据重庆师范大学硕士学位论文中文摘要感染家蚕微孢子虫蚕卵检测靶标的研究摘要微孢子虫是一类广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物的单细胞真核生物，其中家蚕微孢子虫是一类引起家蚕微粒子病的病原微生物，它既可以

3、水平传染，也可以通过胚胎垂直传递给下一代，由于其严重的危害性，已被世界各个国家或地区列为法定检验检疫对象。目前,微孢子虫的检疫主要采用母蛾镜检法，淘汰病蛾所产的卵，每年因微孢子虫烧毁的蚕卵(张)数以千万计，经济损失达数亿元。母蛾镜检法的缺陷是只通过显微镜观察容易将与微孢子虫形态的相似的其他微生物混淆，从而降低检测的准确性。另外，母蛾镜检法对工作人员的技术要求高，过程费时费力。母蛾镜检法是一种间接检验方法，不符合商品成品检测的原则。因此，建立快速、准确、灵敏的成品蚕卵检测方法就显的非常重要。本研究采用感染与未

4、感染微孢子虫的家蚕卵为材料，通过双向电泳技术进行比较蛋白质组学研究，寻找差异蛋白作为成品蚕卵检测的靶标。采用蚕卵差异蛋白作为蚕卵检测靶标具有明显的优点，蚕卵中微孢子虫的数量相对较少。因此，采用卵蛋白具有放大的效果，检测的灵敏性将会提高，而且也符合成品检验的标准。因此，以蚕卵直接检验的方法将会具有更高的生产应用价值。将家蚕在五龄起蚕后的第一天分为两组，100头/组，开始经口添食孢子虫悬浮5液（1×10，实验组）和灭菌水（对照组），一天一次，一次五微升，连续添食两天，继续正常饲喂至结茧，羽化，最后得到感染和未感

5、染微孢子虫的蚕卵，经过镜检母蛾和对应的蚕卵，发现对照组的母蛾和对应的蚕卵中均不含微孢子虫，而实验组中的母蛾和蚕卵都含有微孢子虫。采用裂解法、PBS法和TCA-丙酮沉淀法提取感染和未感染微孢子虫的蚕卵总蛋白，通过SDS-PAGE电泳比较发现，用三种不同处理方法得到的总蛋白具有各自的特异性，其中PBS法得到的蛋白条带多而且清晰。进一步采用双向电泳技术分离感染和未感染微孢子虫的蚕卵总蛋白质，分析差异蛋白质，结果显示感染和未感染微孢子虫蚕卵的差异蛋白质主要集中在30kDa附近，这些差异主要包括：（1）对照组中不表达

6、，实验组中表达；（2）对照组中表达，实验组中不表达；（3）实验组中表达量高而对照组中表达量低；（4）对照组中表达量高而实验组中表达量低。在这些差异中，我们选择了重复性好，差异明显的两个点进行质谱鉴定。经质谱鉴定得到了5种可能的蛋白质：未知功能的蛋白、卵黄原蛋白、低分子I万方数据重庆师范大学硕士学位论文中文摘要量30kDa脂蛋白和气味结合蛋白。经过等电点和分子量大小的对比筛选后，确定该蛋白为家蚕的低分子量30kDa脂蛋白。根据家蚕低分子量30kDa脂蛋白基因设计引物，提取感染和未感染微孢子虫的蚕卵的RNA，用

7、荧光定量PCR分析和验证，验证结果表明，感染了微孢子虫的蚕卵中，Lip30K表达量上调，是未感染蚕卵中表达量的3倍左右。Lip30kD蛋白是成熟蚕卵中主要的一类糖脂蛋白，由脂肪体合成，在胚胎发育的过程中为蚁蚕的孵化提供能量，另外，体内过量表达家蚕30K蛋白有助于病毒感染后宿主的生长。本研究中发现感染微孢子虫的蚕卵中Lip30K基因上调表达，推测是因为微孢子虫在垂直传播给子代的过程中，由于蚕卵要经历一个滞育期，在这一时期，微孢子虫孢子的发育需要吸收部分能量来维持自身的最低能量代谢，同时，又不会伤害到寄主，从而

8、诱导了Lip30K的大量表达。关键词：家蚕，蚕卵，微孢子虫，双向电泳，检测靶标，30K脂蛋白II万方数据重庆师范大学硕士学位论文英文摘要StudyonDetectiveTargetsforSilkwormEggsInfectedbyNosemaBombycisABSTRACTMicrosporidiaareunicellulareukaryotes,obligateintracellularparasites,a