EBV潜伏膜蛋白1基因多态性与非霍奇金淋巴瘤关系的研究

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1、中山大学硕士学位论文EBV潜伏膜蛋白1基因多态性与非霍奇金淋巴瘤关系的研究姓名：刘俊茹申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：吴祥元2003.5.8中山大学硕士学位论文中文摘要EBV潜黜莫蛋白1基因多态胜．引E霍奇金淋巴燃蜥腕专业：内科学硕士生：刘俊茹摘要(EB病毒(Epstein—Barrvirus，EBV)为广泛存在的人类疱疹病毒类DNA病毒，它可感染约95％的人群。已有多项研究证实EBV同多种肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤(Non—Hodgkin’Slymphoma，NHL)的发生有着密切关系。其中潜伏膜蛋白l(1atentmembraneprotei

2、n1，LMPl)基因在EBV的致瘤过程中发挥着重要作用，是目前唯一已经证实具有致瘤性的基因。它通过上调某些抗凋亡基因、激活B细胞表面标志和激活信号传导等途径而发挥其转化活性。近年的研究发现，LMPl基因的多态性与其致瘤性密切相关，尤其对C末端30bp的缺失(del．LMPl)和N末端XhoI酶切位点的丢失(XhoI—loss)的研究比较深入。研究认为30bp缺失(168285．168256)后可导致相应LMPl蛋白功能的改变，缺失后可延长LMPl的半衰期、诱导NF．KB的活性增加、使HLA特异性CTL表位丧失，导致LMPl致瘤性的增强和免疫原性的减弱

3、或丧失，从而使其比其原型株B95．8更易被肿瘤组织所选择，故考虑30bp的缺失在EBV的致瘤过程中发挥着重要作用。关于30bp缺失同EBV相关肿瘤的组织类型、临床进展及预后的相互关系也有人进行了一系列的探讨，研究结果认为伴有30bp缺失的HD、NHL等在组织学上呈高度恶性，临床上表现为疾病进行性恶化或易复发，预后差，故认为30bD缺失可能与疾病的发展及预后密切相关，可作为监测疾病预后的一个指标。XhoI酶切位点的丢失(169425G—T)最初在NPC组织中可检测到且呈高表中山大学硕士学住论文中文摘要达，从而认为该酶切位点的丢失可能在EBV的致瘤过程中

4、也扮演了一个重要角色，被认为是肿瘤的一个特异性标志。但是通过研究其在健康人中的分布情况，结果表明该酶切位点丢失率高低可能仅同当地健康人群中的丢失率分布有关，并非肿瘤特异性。通过测序分析发现不同地区该酶切位点丢失的部位不同，考虑XhoI酶切位点的多态性可能是研究EBV相关疾病的流行病学非常有用的一个分子学标志。通过对EBV相关性肿瘤中LMPI基因的测序分析也发现该基因各个部分均存在一定程度的变异，其中C末端被认为是一个发生点突变的热点，且该区域的点突变几乎都发生在168357—168225nt(322—366aa)这100余个碱基之间，该区间位于NF·

5、KB活化区域，突变后可造成相应NF—KB活化区域氨基酸的改变，影响NF．KB的功能。在氨基末端亦发现很多点突变，氨基端的多态性可能影响LMPl蛋白质降解和LMPl锚定于细胞膜，但具体功能尚不清楚。～}~}目的分析NHL中LMPl基因的多态性(主要是C-末端30bp的缺失和N．末端XhoI酶切位点的丢失)与NHL临床特征的关系，探讨LMPl基因的致瘤机制，并为采用EBV特异性T淋巴细胞防治EBV相关性NHL提供理论依据。<材料和方法1．材料：取B95．8细胞株做阳性对照，收集48例非霍奇金淋巴瘤病人存档的活检蜡块作为研究对象，收集30例健康人咽部漱洗液

6、作为正常对照。2．实验方法：按常规方法分别提取活检蜡块和咽部漱洗液中的DNA作为模板，进一步对所提DNA进行定性、定量和人ki．ras基因扩增以证实所提模板中含有可扩增的DNA。设计合成2对引物，分别扩增LMPl基因的第--#b显子(产物中包含30bp缺失部分)和第一外显子(产物中包含XhoI酶切位点部位)，对第一外显子的扩增产物进行XhoI酶切，进一步对扩增产物进行测序以证实PCR产物的特异性和变异的部位，并分析LMPl基因的其他点突变。观察30bp缺失和XhoI酶切位点丢失在NHL和健康人中分布的差异并进行统计学分析。结合NHL的临床特征，根据国

7、际预后指数(IPI)将其分为预后良好组(IPI3)，分析不同IPI值的NHL与30bp缺失和XhoI酶切位点丢失的关系。3．统计方法：采用四格表精确概率法分析30bp缺失和XhoI酶切位点丢失在NHL和健康人中分布情况的差异以及上述变异与不同IPI的关系，P<0．05为有显著性差异。测序结果采用BLAST分析软件。结果I．48例NHL标本经PCR扩增后共有23例存在EBV感染，30例健康人咽部漱洗液标本中有17例存在EBV感染(LMPl基因有其中一个外显子扩增阳性即可认为存在EBV感染)。2

8、．在第三外显子扩增阳性的NHL中携带30bp缺失型者18例(78％)，原型5例(22％)，同健康人中携带缺失