自溶链霉菌almM基因在自溶霉素生物合成中的作用

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1、TheroleofStreptomycesautolyticusalmMgeneinthebiosynthesisofautolytimycinAdissertationSubmiaedtoYunnanUniversityinfulfillmentoftherequirementfortheawardoftheDegreeofMasterScienceByChengboZhangSupervisedbyProf．TaoLuYunnanInstituteofMicrobiology,SchoolofLifeSciencesYunnanUniversit

2、y,Kunming，Yunnan，ER．China．May,2013独创性声明IIlllllMIIIHlUmllIIRIIII110Y2378966本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人或集体己经发表或撰写过的研究成果，对本文的研究做出贡献的集体和个人均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：李拯里习鱼B论文使用和授权说明本人完全了解云南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文和论文电子版；允许论文被查阅或借阅

3、；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵循此规定)研究生签名：乌拯呈迫导师签名：％崤日本人及导师同意将学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”进行电子和网络出版，并编入CN融系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。．，j，研究生签名：．：一．_．．：导师签名：日期：一_二摘要近年来，以热休克蛋白Hsp90为药物作用靶目标正逐渐成为抗肿瘤药物研究领域的热点。作为具有代表性的一类针对Hsp90的抗肿瘤化合

4、物，苯醌安莎霉素类化合物格尔德霉素(geldanamycin，GM)及其结构类似物引起了人们的广泛关注。格尔德霉素及其类似物能够抑制Hsp90依赖于ATP的功能，使得肿瘤细胞中一些关键蛋白快速降解，最终抑制肿瘤细胞生长或导致肿瘤细胞死亡。我们在前期工作中从放线菌新种自溶链霉菌(Streptomycesautolyticus)的次生代谢产物中发现了格尔德霉素及一个全新的化合物，称为自溶霉素(autolytimycin)。虽然自溶霉素拥有良好的抗肿瘤活性，但是由于对其生物合成途径缺乏了解，严重阻碍了我们通过基因工程手段提高它的产量以及获得新的结构类似物。

5、为了研究自溶链霉菌中参与自溶霉素和格尔德霉素生物合成后修饰的相关基因的功能，我们首先摸索了自溶霉素和格尔德霉素的最佳发酵培养基。通过采用7种不同的发酵培养基进行发酵，我们发现在现有条件下61#培养基是格尔德霉素的最佳发酵培养基。我们也尝试了对61#培养基中的大豆粉成分采用不同预处理方式进行发酵，结果显示不做任何预处理的炒大豆粉是最适合的。在对格尔德霉素生物合成途径中相关后修饰酶的研究中，控制苯醌氧化的单加氧酶的详细作用机制还不清楚。为了了解自溶链霉菌中此单加氧酶的功能，我们采用Red／ET一步PCR法成功地在大肠杆菌中构建了其编码基因almM的插入突

6、变。然后通过接合转移把所构建突变导入自溶链霉菌中，经同源重组成功获得了almM敲除突变株。HPLC分析表明almM基因敲除突变株产生了大量自溶霉素而不是格尔德霉素，同时突变株还产生了几个新的化合物。通过扩大发酵，我们分离并纯化了自溶霉素和它的一个结构类似物。本研究的目的在于了解almM基因在自溶霉素及格尔德霉素生物合成过程中的功能，这将有助于阐明此类化合物生物合成的后修饰机制。该工作为通过基因工程手段提高自溶霉素产量或产生新的化合物提供了切入点。关键词：自溶链霉菌；自溶霉素；生物合成；almM；后修饰机制111AbstractInrecentyear

7、s，targetingheatshockproteinHsp90isbecomingoneofthemostexcitingfieldsincancerresearch．Geldanamycin(GM)andseveralcloselyrelatedcompoundsthattargetHsp90，classifiedasbenzoquinoneansamycins,havedrawnincreasinginterest．GManditsanalogsinhibittheATP-dependentfunctionofHsp90，whichcauses

8、rapiddegradationofsomekeyproteinsincancercellsandthusl