金黄色链霉菌AGR0001中磷氮霉素生物合成的研究

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2、产物生物合成—％，／研究生姓名韩秀林学号２２０１１０００１７２导师姓名文孟良职称教授魯涛职称研究员＿戀Ｉ２０１７年５月＇．－＂＂－＜＇１‘１？．１１－＇４二、＇＇Ｃ，，Ｖ－－．５．／＇＇＇／分毛》＾＾＼，ｒ＼：跟、ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｈｏｓｌａｃｔｏｍｖｃｉｎｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｖｃｅｓａｕｒａｔｕｓＡＧＲ０００１Ａｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ＇Ｓｕｂｍｆｉ

3、ｆｉｒｔｆｒｈｅａｗａｒｔｈｅ．ｉｔｔｅｄｔｏＹｕｎｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｆｕｌｌｌｍｅｎｔｏｔｈｅｒｅｅｍｅｎｏｔｄｏｆＰｈＤｓＤｅｒｅｅｑｕｇＢＸｉｕｌｉｎＨａｎｙＳｕｅｒｖｉｓｅｄｂｐｙＰｒｏｆ．ＭｅｎｌｉａｎＷｅｎｇｇＰｒｏｆ．ＴａｏＬｕＹｕｎｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔ，ｙＫｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ．Ｍａｙ，２０１７扉页：论文独创性声明及使用授权本论文是作者在导师指导下取

4、得的研宄成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，不存在剽窃或抄袭行为一。与作者同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。现就论文的使用对云南大学授权如下：学校有权保留本论文（含电子版），也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文；学校有权公布论文的全部或部分内容，可以将论文用于查阅或借阅服务；学校有权向有关机构送交学位论文用于学术规范审查、社会监督或评奖；学校有权将学位论文的全部或部分内容录入

5、有关数据库用于检索服务。（内部或保密的论文在解密后应遵循此规定）研究生签名：來戈典导师签名：日期：Ｋ／云南大学博士学位论文摘要摘要新憐氮霉素Ａ是我们实验室从金黄色链霉菌（？ＳＹｒ＾ｏ＾Ｍｙ＾ａｓ＾ｕｒａＺｉｔｓＯＡＧＲＯＯＯｌ中筛选出的高效、低毒、无刺激性、低致敏性的新天然产物，具有抗作物病原真菌、抗病毒和抗肿瘤活性，在农药及医药方面具有极高的应用潜力。但是新磷氮Ａ一霉素的产量极低，阻碍了对其的进步研发。了解磷氮霉素生物合成及其调控机制可为进一步对磷氮霉素的

6、生物合成进行遗传改造、特异性地提高新磷氮霉素Ａ的产量或得到结构新颖的类似物奠定基础。在本论文工作中，对５：ａｆ／ｒａｈ＾ＡＧＲＯＯＯｌ中磷氮霉素的生物合成进行了研宄。首先完成了磷氮霉素产生菌Ｓａｉ／ｒａ仏ＡＧＲ０００１的全基因组测序并对其进行了生物信息学分析，。通过序列同源性比对和分析确定了磷氮霉素生物合成基因簇在，经软件拼接和缺口重测序基因组上的位置，得到了磷氮霉素完整的生物合成基因簇，；对磷氮霉素生物合成关键基因进行了分析并绘制了磷氮霉素生物合成基。因簇基因组成

7、结构图，推测了磷氮霉素的生物合成路线ｔＤＮＡ对５：ａｉ／ｒａｗＡＧＲ０００１进行了相关遗传操作研宄，找到了将外源导入的最佳方法。成功地扩增并克隆了２１个与磷氮霉素生物合成相关的基因，并在大肠杆菌中成功构建了其中１５个基因的敲除突变。通过接合转移将所构建的基因敲除５：ａｕｒａｔｉ／ｓＡＧＲ０００１４突变导入中，构建了个基因敲除突变株。对这４个突变株４进行了产物检测和活性实验，均无磷氮霉素产生及抗真菌活性，表明这个基因都参与了磷氮霉素的生物合成。－ｏｒ／Ｊ７利用ＲＴＰ

8、ＣＲ对和７５说两个基因的调控作用进行了研宄。在野生型菌株中磷氮霉素生物合成基因簇中绝大部分基因从第１天到第９天都有表达，而在两个突变株中从第３到第９天与后修饰相关的基因均未见表达，说明这些后修饰基因的表达受０ｒｆ５和ＮｓｄＡ的正调控。调控基因〇成７在突变株Ａ〇设中未检测到表５Ｊ５达，说明该基因也受到Ｏｒｆ的正调控。调控基因ｏｒ／和〇设在第３天和第天在两个突变株中均有表达，表明它们的表达不受０ｒｆ５和ＮｓｄＡ的调控。另外调控基一因〇汾在突变株Ａ