麻疯树Jatrophacurcas花药培养及两个核糖体失活蛋白基因的表达研究

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1、pU川人学博lj学位论文暗培养条件下，1／2MS+IAA0．1mg／L的培养基能诱导愈伤组织生根，但分化率很低，仅6．67％。2．研究了不同激素组合和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响。结果表明，固体培养过程中，PPO和POD活性都出现2次活性高峰，一次在3d，一次在21d(添加N从的出现在24d)，分别与逆境和生长旺盛期相关，悬浮培养出现1次，在12d，出现在生长旺盛期；添加2,4．D和NAA的培养基培养的愈伤组织中，PPO和POD的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6-BA的；光照造成培养方式对PPO活性

2、的影响要大于对POD的影响；在早期PPO和POD的活性都出现高峰，随时『日J的推移，活性都会下降，PPO的下降趋势远高于POD。3．两个原核表=i厶拽体的构建：『1J根捌curcin2基因序列(GenBank奇录号：AY435214)设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物：P1：5’一GGATCC(BamHI)ATGGCTGGTTCCACTT7f-3’；P2：5'-GAGCTC(SacI)ATAcArTGGAAAGATGAGGA．3’，以提取的麻疯树基因组D1qA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物并连接到pMDl8-T载体，获重组子pMD．18T／

3、curein2，转化EcoliJMl09。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamHI和SacI对重组质粒pMD—18T／curcin和表达载体pET-32(c)=．pQE一30进行双酶切，回收目的片段，得到带互补粘性术端的curcin2基因片段(约930bp)和pET-32(c)、pQE．30的线性表达载体。用T4DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32(c)、pQE一30在1(℃下连接，以构建重组表达载体pET-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的EcoliJMl09，经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明目的片段cur

4、cin2正确插入表达载体，成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。。4．两种重组菌的诱导表达：将含有重组子pET-C、pQE．C的EcoliJMl09转化菌于37℃下扩大培养，并提耿质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的EcoliBL21，重组质粒pQE—C转入感受态的EcoliM15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度，不同的诱导时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS．PAGE和Western-blotting检测，结果表明，在任何诱导条件下，重组子PCB都没有

5、curcin2重组蛋白产生，而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白，但主要以包函列川大学博‘L学位论文体形式存在。在本实验设计的诱导条件下，PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16℃，IPTG浓度1mmol·L‘，诱导时I．日J16～24h。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低，诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。5．利用PCR技术从麻疯树基因组中分离到编码麻疯树毒蛋白(curcin)的开放阅读框(OR．F)。结果表明，curcin基因无内含子存在。该序列定向克隆到植物双元表

6、达载体pBI121质粒，获得植物表达载体pBI121．curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。在含卡那霉素的MS2(MS+6一BA0．1mg／L+Karl100mgrL)培养基上诱导丛生芽，诱导率40％左右。丛生芽在形态上有90％是TF常的。TF常丛生芽在MS3(MS+Kan100mg／L)培养基上诱导生根，生恨率达到90％左存。最后将再生苗移栽到土壤中培养，成活率达95％。再，七曲经过PCR检测证明15株中有13株整合了curcin基凼。经过RT-PCR检测，有10株在转录水平上得到表达。转基因烟草对力枯丝核菌(Rh

7、izoctoniasolani)有一定程度的抗性。关键词麻疯树花药培养核糖体失活蛋白基因表达curcin蛋白curcin2蛋白列州大学博，I。学位论文AntherCultureandExpressionofTwoRipGenesinJatrophacurcasMajor-BotanyPH．D．Candidate：LUOYan-yunSupervisor：Prof．CHENFangABSTRACTJatrophacurcasL．belongstoEuphorbia，withremarkableanticanceractivity．Itnotonly

8、hastremendouspossibilitiesinindustrialoilusing，biologicactivelyabout