一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达.pdf

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1、456植物生理学报PlantPhysiologyJournal2012，48(5)：456～464一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达严安心，谢瑜，吉柔风，李诗娟，徐莺，陈放四川大学生命科学学院，成都610065摘要：首次从麻疯树,~LcDNA丈库中克隆得到一个R1NG型锌指蛋白基因(GenBankf录号为JF920726)，命名为R，』。该cDNA长度为728bp，包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框(5l6bp)。R，基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶>茎>花>果实>种子>根。将克隆到的JcRFP1基因的CDNA序列连接到表达载体pET3

2、2af+)上，导~BL21(DE3)pLysS~株，成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔，得到效价为1：6500的抗血清研究表明，JcRFPI蛋白具有体外泛素连接酶E35-~性，在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。关键词：麻疯树；RING指蛋白；原核表达；泛素连接酶；油菜素甾醇CloningandExpressionofaRINGFingerProteinGeneJcRFP1fromJatro—phacurcasL．YANAn．Xin，XIEYu，JIRou-Feng，LIShi．Juan，XUYing，CHENFangSch

3、ooloyLifeSciences，SichuanUniversity,Chengdu610065，ChinaAbstract：AnovelRINGfingerproteingenewasclonedfromJatrophacRrcasendospermcDNAlibrary(Gen—BankAccessionNo．JF920726)．namedJcRFPi．1hecDNAlengthwas728bpincludingthecompletecodingsequence(516bp)ofJcR_FP1．Rgeneexpressioncouldbedetectedinallorgans

4、ofCHYcas．andtheex—pressionlevelsaredifferentasfollowsleastem>flower>fruit>seed>root．尺FP1cDNAwasligatedintotheexpressionplasmidpET-32af+1andasolublefusionproteinwiththemolecularweightof33．2kDawasex．pressedsuccessfullyinE．colistrainBL21(DE3)pLysSincludingtherecombinantplasmidpET32at+、一JcRFPl△N．T

5、hereafter,thefusionproteinwasusedtoimmunizetheNewZealandwhiterabbitsandthepolyclonalantibodywasobtained．whichcouldbedilutedintol：6500duringwesternblotanalysis．ThestudyshowedJcRFP1hadinvitroubiquitinligase(E3)activityandmightparticipateinbrassinosteroidsignal仃ans-ductionpathwaysin~curcas．Keywor

6、ds：JatrophaCHFCaSL．：RINGfingerprotein；prokaryoticexpression；ubiquitinligase；brassinosteroid锌指蛋白在真核生物中广泛存在，参与细胞泛素．蛋白酶体途径是真核生物特有的蛋白的分化、增殖和凋亡等多种生命过程。蛋白的锌质降解途径，包括底物蛋白泛素化和蛋白酶体降指结构是由若干保守的半胱氨酸及组氨酸残基同解两个过程。底物蛋白泛素化需要泛素激活酶锌离子结合而形成的相对独立的“指”状四面体结(ubiquitinactivatingenzymes，E1)、泛素结合酶构。根据与锌离子结合的保守的Cys~His组合

7、的(ubiquitin—conjugatingenzymes，E2)和泛素连接酶不同，可以把锌指结构分为C2H2、C2HC、C3H、(ubiquitinligases，E3)共同作用：首先E1在ATP作用C3HC4、C3H2C3、C4、C4HC3、C6等多种类下激活泛素(ubiquitin，Ub)，形成E1一Ub；然后活化型。C3HC4、C3H2C3型锌指结构又分别称为的泛素被转移至E2，形成E2一Ub；最后E3募集RING．HC、RING—H2锌指，是RING指结构