纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第5期2010年5月ChineseJournalofAnalyticalChemistry627~631DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00627纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白全灿刘军(中国计量科学研究院化学分析所,北京100013)摘要建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰,在其表面同定特异性蓖麻毒单抗并作为探针,用于蓖麻毒蛋白的检测。采用场流分离技术对纳米颗粒探针进行准确表征,并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。结果表明:通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米

2、颗粒表面结合的蛋白,此纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合,应用于目标蛋白的检测。关键词纳米颗粒探针;蓖麻毒素;核糖体失活蛋白;场流分离;扫描电镜;聚苯乙烯1引言核糖体失活蛋白(Ribosome—inactivatingproteins,RIP)存在于许多植物中,植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用,即抵抗病虫害或者恶劣的环境。根据蛋白质的一级结构,RIP可以分成两类:I型,由一条多肽链组成;Ⅱ型,是双链蛋白。Ⅱ型双链RIP由2条或者4条多肽链组成,分子量约为60或120kDa,其中一条是A(Active)链,具有Ⅳ一糖苷酶活性;另一条是B(Binding)链,这

3、两条链通过二硫键和非共价键连接,。蓖麻毒是一种典型的核糖体失活蛋白,由于蓖麻毒来源广泛,禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒列为最为严格的控制对。因此,开展对蓖麻毒等核糖体失活蛋白的检测研究具有重要意义。目前,检测核糖体失活蛋白的方法有免疫分析法和生物质谱法。。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白检测中’”。场流分离(Fieldflowfractionation,FFF)是Giddings提出的一种新的分离分析理论’,它将流体与外加场联合作用于样品,实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中范围为0.02~1m的悬浮物颗粒,也可

4、作为一种表征技术对样品中纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同,可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支,其中沉降场流分离(Sedimentationfieldflowfactionation)技术较为完善且应用较多。本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体,经表面修饰后在其表面固定特异性单抗,利用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征,测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子数目,并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白,此纳米颗粒探针能够与

5、核糖体失活蛋白的特异性结合,可应用于目标蛋白的检测。2实验部分2.1仪器与试剂沉降场流分离仪(Postnova,uT,USA);AntonPaarDMA(60/602)振动管密度计(奥地利AntoPaar公司);场发射扫描电镜(LEO1550EDs/0PAL/EBsD/sTEM,Zeiss,Thornwood,USA);SputterCoaterSC7640离子溅射仪(QuorumTechnologies,UK);NAP一5及NAP一10凝胶渗透柱(通用公司);5417C离心机(德国Eppendrof公司)。蓖麻毒素A链(RicinAChain,纯度98.99%)及其单抗IgG均由美国农

6、业部西部研究中心友情提2009-08一I6收稿;2009-l2-03接受本文系中国科技部创新方法工作々项(No.20081M021900)资助E—mail:superfluidcan@hotmail.oom628第38卷供;聚苯乙烯纳米颗粒(240YIITI,10%,z/,BangsLaboratoriesInc。PA,USA);NH4HCO3(>99.5%)、表面活性剂FI一70(Fisher公司);实验用水为Milli—Q超纯水(>18MQ)。纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯一聚氧丙烯.聚氧乙烯嵌段共聚物(F108一PDS)、3一(2一吡啶二巯基)丙酸Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺酯(SP

7、DP)、二硫苏糖醇(DTr)和磷酸盐缓冲液,pH7.4)购自Sigma公司。2.2实验方法2.2.1离心沉降分离检测技术场流分离技术可视为一种单相的色谱技术,其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进人通道后,样品将暂停一段时间(即Relaxationtime,停留注射或松弛步骤)。此时样品中的不同组分由于物理性质的差异,在外

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