肺癌外周血中EGFRmRNA、SPDmRNA、LUNXmRNA表达的临床意义

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1、肺癌外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达的临床意义作者：仲崇俊，蒋庚西，陶国华，王永旺【摘要】目的：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测肺癌患者肿瘤组织和外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达，探讨其作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法：应用RT-PCR技术检测40例非小细胞肺癌组织和15例肺良性病变组织中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达；检测40例肺癌患者外周血中靶基因的表达，并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作为对照。结果：40例肺癌患者病理组织中EGFRmRNA、

2、SP-DmRNA、LUNXmRNA的表达率为77.5%（31/40）、100%（40/40）、100%（40/40），外周血中EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达阳性率分别为55.0%（22/40）、52.5%（21/40）和57.5%（23/40）；对照组中15例肺良性病变患者病理组织中EGFRmRNA表达率为13.3%（2/15），无SP-DmRNA和LUNXmRNA表达，15例肺良性病变患者和10名健康人的外周血中无EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA表达。结论：EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA作为检测肺癌组织及肺

3、癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感度和特异性；三者表达与肺癌TNM分期、组织学类型和癌细胞分化程度关系密切。9【关键词】肺肿瘤；微转移；表皮生长因子受体；肺表面活性蛋白D；肺特异性蛋白X　肺癌细胞在术前、术中脱离原发灶，以非常少的数量转移到淋巴结、血液、骨髓或远处器官中，常规临床检查难以发现，此为肿瘤的微转移。RT-PCR技术的发展，使检测外周血中微量癌细胞成为可能。但目前在肺癌微转移的检测中，缺少公认的特异的分子标记物[1]。本实验采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测了40例非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血中EGFR、SP-D和LUNX的表达，分析其与病

4、理生理学特征的关系，以探讨靶基因作为诊断肺癌微转移的价值。　　1材料和方法　　1.1一般资料病例40例NSCLC患者均来源于本院胸心外科手术患者，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移，其中，≥55岁31例，＜55岁9例，男30例，女10例，腺癌22例，鳞癌18例；另选15例肺部良性疾病患者（包括良性肿瘤、肺大泡、支气管扩张等）及10名健康人作为对照组。　　1.2试剂与引物设计参照GenBank，采用Primer9Premier5引物设计软件设计EGFR、SP-D和LUNX基因内外引物，EGFR上游:5'-CATCTCCGAAAGCCAACA-3'，EGFR下游:5'-

5、CGACGGTCCTCCAAGTAG-3'，扩增产物长度244bp；SPD上游:5'-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3'，SPD下游:5'-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3'，扩增产物长度178bp；LUNX上游:5'-GGGCATTCTGGAAAACCT-3'，LUNX下游:5'-GGCGTATTCACTTGGAGC-3'，扩增产物长度237bp；内参引物为GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）以检测RNA的完整性，GAPDH上游:5’-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3'，GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，

6、扩增产物长度306bp，由上海生工合成。　　1.3标本的收集与总RNA抽提对所有肺癌患者于治疗前抽取新鲜肝素抗凝血5ml，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol试剂一步法抽提总RNA，另对手术切除肿瘤于手术室内切取小块新鲜肿瘤组织液氮速冻保存，取约50~100mg行总RNA的抽提。　　1.4RNA鉴定对所抽提的总RNA行紫外分光光度定量，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察。cDNA第一链合成取样品总RNA约2μg加入20μl反应体系中，按照试剂盒提供的条件进行逆转录。　　PCR扩增EGFRmRNA、SP-DmRNA、LUNXmRNA与GAPDH(内参)。按照文献报道方法[4

7、~6]，结合实验优化条件进行。具体反应条件分列如下：9EGFR、SP-D、LUNXPCR反应体系25μl，其中cDNA2μl,10×PCRbuffer2.5μl,TaqDNA5U/μl聚合酶0.2μl,2mmol/LdNTPmix2.5μl,20mmol/LMgCl21.5μl,EGFR上、下游引物(10pm/L)各1μl,加入适量的双蒸水，使总体积达25μl。反应条件:95°C预变性5min,95°C变性45s，50°C45s，72°C45s，共45个循环，在第15个循环末时加入GAPDH上、下游引物