鸡IgY轻链可变区ScVL基因T7PDT文库构建

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1、Y937663单位代码!Q§3§学号2QQ331Q西南矢謦硕士学位论文鸡IgY轻链可变区(ScV。)基因T7PDT文库构建论文作者：朱萍霞指导教师：黄伟副教授学科专业：基础兽医学研究方向：兽医生物技术提交论文日期；2006年6月1日论文答辩日期：2006年6月5日学位授予单位：西南大学中国·重庆2006年6月西南大学硕士学位论文体对抗原的结合力，无限量的合成和表达实际上可针对任何抗原的抗体分子。因此，本研究的目的就是利用噬菌体表面展示技术构建一个鸡单链抗体基因文库，这为快速研制新抗体奠定基础。研究方法：(1)根据Genbank报道

2、的鸡IgYVl框架区(Framework，FR)FRl和FR4设计VH、VL的上下游引物，并引入克隆位点；设计亲水性的(Gly4Ser)3多肽DNA接头(Linker)；(2)从8周龄鸡脾脏中提取总RNA，以Oligo(dT)为引物反转录合成cDNA，作为模版，在VH、VL上下游引物作用下PCR扩增获得VH和VL基因，利用重叠(Overlap)PCR将vH和VL通过人工合成的Linker连接成VwLinker-VL，即ScFv基因；(3)通过Sad和NotI酶切重组入T7select10-3b中，经体外包装后转染E．coliBLT

3、5403株即获得鸡ScFv基因T7PDT文库；(4)通过噬菌斑计数库容量，任取6个噬菌斑进行PCR鉴定，纯化PCR产物，测序，并与Genbank中鸡IgV基因序列比对。(5)选择4种抗原进行生物淘洗；(6)AIV和GPV两种抗原生物淘洗阳性克隆噬菌体液进行ELISA竞争阻断试验：(7)抗GPVScVL砸克隆到表达载体pET28b(+)中，转染Tuner进行诱导表达，纯化表达蛋白，采用竞争ELISA检测表达蛋白的抗体活性。研究结果：(1)意外获得鸡IgY轻链可变区基因PDT文库，命名为鸡IgY单轻链抗体可变区(Singlechain

4、oflightvariableregion，ScVL)基因T7PDT文库。测得库容为4．5x106pfll，ScVL片段大小为450bp；(2)ScVL序列包含有鸡lgYVL基因、Linker序列、未知序列(2top)及重链可变区上游H5引物序列。(3)AIV和OPV抗原生物淘洗均获阳性克隆SCVL／AIV和SCVL／GPV，四轮淘洗后噬菌斑回收率分别增加了1639和61倍。(4)ScVdAIV和ScVI／GPV噬菌体培养液ELISA竞争阻断试验的抑制率分别为17．6％和14．6％。(5)Sc％jGPV克隆在EcoliTuner中

5、表达产物为可溶性蛋白质，分子量为23kD，竞争ELISA检测抑制率达到28％，说明GPVScVL具有抗体亲和性。结论：构建起了鸡IgYScVL基因T7PDT文库。从该文库中成功筛选到抗GPv的ScVL基因克隆在EcoliTuner中表达。关键词：鸡IgY轻链可变区噬菌体展示基因文库ⅡConstructionofSingle．chainLightVariableRegion(ScVL)LibraryofChickenIgYGenesbyT7PhagedisplaytechnologyCandidateZhuPing—xiaSuper

6、visorHuangWet(CollegeofAnimal＆Technology,SouthwestUniversity,Chongqing,China402460)AbstractThreeimmune。globulinclasseshavebeenshownt0existinchicken．IgY．19MandlgA．Theanti·maladiesfunctionoflgYissimilartomammalian19G．butthestructureoflgYisdifferenttomammalianlgG．19Yisco

7、mposedoftwoheavychaMsandtwolightchains，butnohingeregion01"1theheavychain．Theantigenbindingregionsareformedbytheinteractionofthevariablelight(V1)andvariableheavy(VH)domainsatthemninoterminiofthechain．Thethreecomplementarity-determiningregions(CDRs)，locatedinthevariable

8、region,arethespecificboundregionswithantigenepitope．IthasbeenshownthatVLofIgYisencodedbytheVxandJxgenes．ThemechanismofIgYlig