抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达论文

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1、抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达论文.freelAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，经RT-PCR扩增VH单域抗体基因，将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达.结果VH单域抗体基因全长363bp，含起始码和终止码.将其克隆到pGEX-4T-1内，转化大肠杆菌DH5α，获得高效表达，表达量占全菌总蛋白质的38%.freelainantibody;cloning;expressionAbstract:AIMToamplifytheVHsingledomaingeneofan-ti-prostatespecificantigen（

2、PSA）monoclonalantibody（mAb），andexpressitinE.coli.METHODSTotalRNAthehybridomacelllineE4B7，ainantibodygeneplifiedbyPCR，clonedintotheprokaryoticfusionproteinexpres-sionvectorpGEX-4T-1andexpressedinE.coli.RESULTSTheVHsingledomainantibodygeneconsistedof363bp，edintoE.coliDH5α.Clonesharborin

3、gplasmidpGEX-VHproduceda40kDaoffusionproteininE.coliatalevelof38%ofthetotalcellularprotein.Afterprimarypu-rificationandrenaturation，thefusionproteinatography.ThefusionproteinbinandtheVHsingledomainanti-bodyainantibodyedbypetitivebindingin-hibitionassayinvitro.CONCLUSIONAnti-PSAsingled

4、o-mainantibodyhasbeensuccessfullyconstructedfortheuseinclinicalstudies.0引言前列腺特异抗原（Prostatespecificantigen）是一种灵敏度较高的前列腺癌肿瘤标志物，131I标记抗PSA单克隆抗体用于前列腺癌放射免疫显像，有较高的灵敏度和特异性［1］.针对鼠源性单克隆抗体对人体存在着免疫原性的问题，自20世纪80年代以来基因工程抗体的研究愈来愈受到重视，其中重链可变区（VH）单域抗体由于只有一个功能区，保留了较好的抗原结合能力，在制备和应用上有其优点.我们应用RT-PCR方法从抗P

5、SA单克隆抗体的杂交瘤细胞系E4B7中扩增出VH单域抗体基因，在大肠杆菌中获得了高效表达，并进行亲和活性测定.1材料和方法1.1材料E.coliDH5α受体菌，本室保存.质粒pUC19和pGEX-4T-1由本校生物化学教研室白玉杰博士惠赠.小鼠杂交瘤细胞系E4B7由本室制备，保存并培养.人前列腺癌细胞株PC-3，由北京医科大学病理教研究室从美国引进.反转录试剂盒（Promega）;RapidDNALigationKit（BoehringerMannheim）;AdvantageTMPCR-PureKit（Clon-Tech）;PlusMiniprepsDNAPur

6、ificationSystem（Promega）;各种限制性内切酶，核酸分子质量标记物，凝血酶等购自华美公司和Promega公司.PCR引物HeavyPrimer1和2:Pharmacia公司产品，是噬菌体呈现系统中的混合引物.设计一对含有EcoRI-起始码和终止码-SalI的VH引物，上游引物A为:5′-GCGAATTCATGCAGGTCCAACTGCAGGA-3′，下游引物B为:5′-GCGTCGACTTATGAGGA-GACGGTGACCGTGG-3′，该引物在美联（西安）生物公司合成.1.2方法1.2.1细胞总RNA的提取和逆转录培养小鼠杂交瘤细胞E4B7

7、，至对数生长期.收集细胞2×107个，提取细胞总RNA［2］，逆转录反应按ReverseTran-scriptionsystem，USAPromega说明书进行.1.2.2VH基因的PCR扩增采用PE公司2400型扩增仪进行反应，第一轮PCR应用引物HeavyPrimer1和2，扩增条件是先94℃预变性5min，后按94℃60s，55℃90s，72℃120s进行30个循环后，继续在72℃延伸10min.取5μLPCR产物进行15gL-1琼脂糖凝胶电泳分析，用AdvantageTMPCR-PureKit回收，以回收物为模板，用引物A和B进行第二轮PCR.1.2.3V

8、H基因的克