鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达.pdf

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1、ISSN1007—8738；fChinJCellMollmmuno1)2010，26(5467·论著·文章编号：1007—8738(2010)05—0467-04鼠源性抗人HAAHmAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达汪桦，薛小平，雷迎峰，宋凯，呼延霆，王伟，杨慧(西北工业大学生命科学院，陕西西安710072；第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西西安710032)befurtherstudiedabouttheirbiologicalactivityandapplica-Cloningofthevaria

2、bleregiongenestion，duetotheirhighafinityshowninpreliminarydetection．fromhybridomaagainstHAAHand[Keywords]humanaspartyI／asparaginylbeta。hydroxylase；thenconstructionandexpressionofan-scFv；variableregionofantibody；mAb；pro-ti．HAAHscFvteinexpression[摘要]目的：从分泌抗人类天

3、冬氨酰基B一羟化酶(HAAH)WANGHua。，XUEXiao-ping，脚Ying-feng，SONG单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3／FI1中，克隆出鼠源an—Kai，HUYan—ring，WANGWei，YANGHuiti—HAAHmAb重、轻链可变区基因，构建Anti·HAAH的单链FacultyofLifeSciences，NorthwesternPolytechnicalUniversity，抗体(scFv)，并进行scFv基因的蛋白表达。方法：提取杂交Xi’an710072；Departmen

4、tofMicrobiology，FourthMilitary瘤细胞G3／F11的总RNA，通过RT—PCR扩增出V和V基MedicalUniversity，Xi’an710032，China因；再利用重叠延伸PCR(SOE—PCR)，通过设计在引物上的linker序列，将VH和V拼接为完整anti-HAAHscFv基因。fAbstractIA：Constructionandexpressionofanti-将测序正确的scFv基因克隆人pHEN1载体，并利用EcoliHAAHsinglechainvariabl

5、efragment(scFv)bycloningofHB215I进行蛋白表达；通过SDS—PAGE，Westernblot分析其thevariableregiongenesfr0manti—HAAHhybridomacells表达状况，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序结果显G3／F11．METHODS：TOtaIRNAwasextractedfr0mhybri—示，本实验成功地构建出鼠源anti—HAAHV一linker—VLscFv基domacellsG3／FI1．ByRT-PCR，murineVHa

6、ndVLgenes因，且V、V均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决ofmAbwereamplifiedrespectively．Then，Theywereas-定区结构，所得的scFv基因片段全长?4bp，编码248个氨sembledintoVH-linker—VLscFvtemplatebySoE—PCRand基酸。SDS．PAGE和Westernblot分析表明，pHENl—anti—anti—HAAHscFvwasexpressjnEco／／byconstructedpHENHAAH在E．coliHB2

7、151可表达为，约27000的可溶性scFv1．Anti—HAAHvector．TheexpressionofAnti-HAAHscFv蛋白，表达量为7．8％。间接ELISA检测显示，可溶性鼠源weredetectedbVSDS-PAGEandWesternblottingandtheanti．HAAHscFv蛋白具有较高的抗原结合活性。结论：成功bindingactivityweredemonstratedbyELISA．RESULTS：扩增出的鼠源anti—HAAHmAbV区和V区基因，并构建为Theana

8、lysisofDNAsequencingshownthatthefull·lengthanti—HAAHscFv基因。然后，利用pHEN1载体对anti—HAAHofconstructedscFvgenewas744bp，encoding248aminoscFv基因进行成功表达，为进一步研究其生物活性及应用奠acids．Moreover，theVHandVLgeneswerefunct