迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定.pdf

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1、第30卷第6期西安交通大学学报(医学版)V0I．30N0．62009年12月JournalofXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences)Dec．2009论著迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定秦红，金晓航，黄威权，刘玉林。(第四军医大学基础部：1．组织学与胚胎学教研室；2．药品研究’中心，陕西西安710032)摘要：目的构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因。方法采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1

2、El1)中克隆出Vn和V可变区基因，再通过重叠延伸拼接PCR方法在Vn和V可变区基因之间引入连接肽(G1ySer)，体外构建单链抗体基因；将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达，表达产物纯化后，用SDS-PAGE、Westernblot及ELASA进行鉴定。结果迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达，表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体、纯化和体外复性，获得了高纯度的单链抗体片段，重组蛋白的分子质量为27ku。ELAsA分析结果证实迟缓爱德

3、华菌抗独特型单链抗体基因seFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv，为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础。关键词：迟缓爱德华菌；抗独特型；单链抗体中图分类号：R392．11文献标志码：A文章编号：1671—8259(2009)06—0689—05Construction．expressionandidentificatiOnoftheanti—idiotypicsinglechainvariablefragmentag

4、ainstEdwardsiellatardaQINHong，JINXiao～hang，HUANGWei—quan，LIUYu—lin(1．DepartmentofHistology&Embryology；2．CenterforPharmaceuticalResearch，SchoolofBasicMedicine，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China)ABSTRACT：ObjectiveToconstruct，expressandid

5、entifytheanti．idiotypicantibodysinglechainvariablefragment(scFv)againstEdwardsiellatarda．MethodsByusingRT-PCRmethod。thevariableregionsoftheheavyandlightchainoftheanti-idiotypicmonoclonalantibody(mAb)1El1againstEdwardsiellatardawereclonedandjoinedwith

6、a(Gly4Ser)3linker，andthescFvintheorientationofVL—linker-VHwasconstructed．ItwasthenclonedintovectorplasmidpET-28a，expressedinEscherichiacoliBL21(DE3)，andconfirmedbySDS-PAGE，WesternblotandELISA．ResultsTherecombinantscFvcouldbeexpressedinE．coliBL21(DE3)

7、inafusionproteinpattern．Theexpressionproductwasintheformofaninclusionbodyandthepurifiedfusionproteinwasobtainedafterbeingpurifiedandrefolded．TheSDS-PAGEandWesternblotanalysisshowedthatthemolecularweightofscFvproteinwas27ku．IndirectELISAconfirmedthatt

8、hescFvhadthebindingactivitytotheantigen．ConclusionTherecombinantanti-idiotypescFvhasbeensuccessfullyconstructedandexpressedinE．coliBL21(DE3)，providingthebasisandpotentialforpreparationofgeneticallyengineeredvaccineagainstEdwardsiellatarda．KEYWoRDS：Ed