海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区磷酸化p38MAPK的蛋白表达的影响

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1、海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区磷酸化p38MAPK的蛋白表达的影响作者：王莹杜克莘施京红谢雯【摘要】目的：观察海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区的磷酸化p38MAPK（pp38）表达的影响，探讨p38MAPK细胞信号转导通路是否参与了发育早期海洛因暴露引起子代脑发育损伤的分子机制.方法：于胚胎鼠龄9～18d时给孕鼠皮下注射海洛因10mg/(kg·d)，建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型.按出生前处理将小鼠分为海洛因和盐水组.蛋白免疫印迹检测两组小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区pp38的表达改变.结果：与盐水组相比，

2、海洛因组小鼠的pp38蛋白表达在前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核4个脑区均有明显增加(P<0.05).结论：海洛因暴露可引起小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区的pp38MAPK蛋白表达上调，提示p38MAPK信号通路可能参与了海洛因损伤小鼠神经发育的分子机制.【关键词】海洛因；p38丝裂原活化蛋白激酶；前额叶皮层；海马；伏核；杏仁核0引言近年来，女性毒品滥用者增多，且大多属于育龄期妇女［1-2］.7研究表明，子宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍［3-4］，

3、但其细胞、分子机制未完全阐明.p38是MAPK(mitogenactivatedproteinkinase)超家族的重要成员之一，属于应激活化激酶，p38MAPK不但与其他信号传递途径共同介导细胞应激诱发的基因表达和酶活性的改变，还在细胞凋亡、细胞因子的合成释放、细胞骨架重排等机制中发挥重要作用［5-6］.本研究旨在探讨p38MAPK通路是否参与了海洛因导致后代神经、行为异常的机制.1材料和方法1.1材料标准品海洛因（heroin），学名二乙酰吗啡，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供，批号171206

4、-200614.兔抗鼠磷酸化p38MAPKmAb，山羊抗βactinpAb（美国CellSignalling公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔或山羊二抗（博奥森公司）；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜及Hyperfilm胶片（德国Merck公司）；蛋白质提取及浓度测定试剂盒（美国BioRad公司）.FS600超声波粉碎仪(上海生析超声仪器有限公司)；离心机（德国Eppendorf公司）；电泳仪（德国WhatmanBiometra公司）；紫外成像扫描仪及分析系统（美国BioRad公司）.1.2方法1.2.1动物分组及模

5、型建立选健康活泼BALB/c小鼠60只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄各半，2mo龄，体质量(25±5)g.自由饮食饮水，昼夜12h交替光照，室温25℃，湿度60%左右.每日21∶007雌雄合笼，次日晨查精栓或阴道涂片，以精栓或阴道涂片查到精子做为受精标志，记为E0d.将体质量相近的实验动物随机分为海洛因组和盐水组.从E0～E8各组动物自由进食,E9～E18d，盐水组于21∶00在小鼠大腿外侧皮下注射生理盐水20mL/（kg·d），1/d，海洛因组组给予海洛因10mg/（kg·d）注射，1/d，将药物溶于生理盐水中，0.5g/L.

6、子代分组同亲代孕鼠.1.2.2蛋白印迹实验仔鼠30d龄时在各脑区取材，0.16mol/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，速断头、开颅、分离各脑区，即刻入液氮，冻存管分装，-80℃贮存.用时加入4℃胞质蛋白提取液裂解，20∶1加入蛋白酶抑制剂PMSF，高速分散器组织匀浆，冰浴1h，12000g4℃离心10min，沉淀加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4℃离心30min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，取上清加等体积2×SDS样品缓冲液，煮沸5min使蛋白变性.取50μg待测蛋白加入等体积2×上样缓冲液煮沸5

7、min，行SDSPAGE电泳，蛋白半干转至PVDF膜.100V恒压转移2h后，将PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1h，与1∶1000一抗pp38MAPK兔多抗4℃孵育过夜，PBST缓冲液洗膜3次，每次10min；随后加入羊抗兔IgGHRP37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min.ECL化学发光试剂显影，胶片曝光，UVP凝胶成像系统扫描目的条带，Labworks软件测量各阳性条带的光密度，将pp38MAPK阳性条带与相应的βactin条带吸光度比值作为其蛋白的相对表达量.统计学处理：所有数据均采用SPSS12

8、.0进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析.72结果分析各组间相应蛋白带的平均吸光度值，以βactin作内参蛋白，调整后进行半定量分析.与盐水组相比，海洛因组动物的前额叶皮层、海马、伏核和杏仁核4个脑区组织的p38MAPK磷酸化