海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区磷酸化p38 mapk的蛋白表达的影响

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1、海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区磷酸化p38MAPK的蛋白表达的影响【摘要】目的：观察海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区的磷酸化p38MAPK（pp38）表达的影响，探讨p38MAPK细胞信号转导通路是否参与了发育早期海洛因暴露引起子代脑发育损伤的分子机制.方法：于胚胎鼠龄9～18d时给孕鼠皮下注射海洛因10mg/(kg·d)，建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型.按出生前处理将小鼠分为海洛因和盐水组.蛋白免疫印迹检测两组小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区pp38的表达改变.结果：与盐水组相比，海洛因组小鼠的pp38蛋白表达在前额叶皮层

2、、海马、伏核、杏仁核4个脑区均有明显增加(P<0.05).结论：海洛因暴露可引起小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区的pp38MAPK蛋白表达上调，提示p38MAPK信号通路可能参与了海洛因损伤小鼠神经发育的分子机制.【关键词】海洛因；p38丝裂原活化蛋白激酶；前额叶皮层；海马；伏核；杏仁核0引言近年来，女性毒品滥用者增多，且大多属于育龄期妇女［1-2］.研究表明，子宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍［3-4］，但其细胞、分子机制未完全阐明.p38是MAPK(mitogen

3、activatedproteinkinase)超家族的重要成员之一，属于应激活化激酶，p38MAPK不但与其他信号传递途径共同介导细胞应激诱发的基因表达和酶活性的改变，还在细胞凋亡、细胞因子的合成释放、细胞骨架重排等机制中发挥重要作用［5-6］.本研究旨在探讨p38MAPK通路是否参与了海洛因导致后代神经、行为异常的机制.1材料和方法1.1材料标准品海洛因（heroin），学名二乙酰吗啡，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供，批号171206-200614.兔抗鼠磷酸化p38MAPKmAb，山羊抗βactinpAb（美国

4、CellSignalling公司）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔或山羊二抗（博奥森公司）；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜及Hyperfilm胶片（德国Merck公司）；蛋白质提取及浓度测定试剂盒（美国BioRad公司）.FS600超声波粉碎仪(上海生析超声仪器有限公司)；离心机（德国Eppendorf公司）；电泳仪（德国SF，高速分散器组织匀浆，冰浴1h，12000g4℃离心10min，沉淀加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4℃离心30min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，取上清加等体积2×SDS

5、样品缓冲液，煮沸5min使蛋白变性.取50μg待测蛋白加入等体积2×上样缓冲液煮沸5min，行SDSPAGE电泳，蛋白半干转至PVDF膜.100V恒压转移2h后，将PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1h，与1∶1000一抗pp38MAPK兔多抗4℃孵育过夜，PBST缓冲液洗膜3次，每次10min；随后加入羊抗兔IgGHRP37℃孵育1h，洗膜3次，每次10min.ECL化学发光试剂显影，胶片曝光，UVP凝胶成像系统扫描目的条带，LabAPK阳性条带与相应的βactin条带吸光度比值作为其蛋白的相对表达量.统计学处理：所有数据均采

6、用SPSS12.0进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析.2结果分析各组间相应蛋白带的平均吸光度值，以βactin作内参蛋白，调整后进行半定量分析.与盐水组相比，海洛因组动物的前额叶皮层、海马、伏核和杏仁核4个脑区组织的p38MAPK磷酸化蛋白表达均明显增加（P<0.05，图1，2）.3讨论MAPK信号系统作为真核细胞内各种信息传递的最后通路和共同通路，能够将细胞外的各种刺激信息转移到细胞核内，是神经细胞发生一系列可塑性变化的分子基础.p38MAPK多见于促炎和促凋亡的途径中，它在细胞分化、凋亡、迁移和增殖等基本生理过程中也发挥着不可忽视

7、的作用［5］，许多细胞外刺激如应激刺激、炎性细胞因子、细胞因子、脂多糖、生长因子等通过细胞内信号转导通路激活p38MAPK，进而磷酸化激活MAPKAPkinase2等，并最终激活ATF2，Max和MEF2等转录因子而产生生物学效应［6］，但其具体调制及与其他信号通路之间的关系尚未明了.海洛因暴露导致的行为异常与海洛因作用的时间、时程、剂量和给药方式等有密切关系，作用方式不同可导致的行为学损伤不完全相同.我们采用的模型已报道动物有成年后迷宫学习记忆行为缺陷［7］，海马胆碱能系统及PKC细胞学定位的改变［8］.海洛因可迅速通过胎盘和血脑屏障，直接作用

8、于发育中的神经细胞，导致子代成年后的神经行为损伤，但其细胞、分子机制未完全阐明.我们的结果显示，发育早期海洛