JNK与p38介导低钾诱导的cJun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡

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1、中山大学硕士学位论文JNK与p38介导低钾诱导的c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡姓名：谢元斌申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：朱振宇;黎明涛2003.5.21中山大学硕士论文2NK与p38介导低钾诱导的c-Jim磷酸化及小脑颗粒神经元鞠亡JNK与p38介导低钾诱导的c．．．Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡专业：生物化学与分子生物学硕士生：谢元斌指导老师：朱振宇教授黎明涛副教授摘要仆脑颗粒神经元是哺乳动物脑中最丰富的中枢神经元。体外培养该神经元{时，含25n[1h4KCl(高钾)的培养基可维持小脑颗粒神经元的分化、成熟和存

2、活，而去血清、复极化浓度的KCI(5raM，低钾)培养基可诱导分化成熟的小脑颗粒神经元凋亡。正因为小脑颗粒神经元来源丰富、体外培养的同质性高，所以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究和防治与凋亡有关的神经系统疾病的新药开发中。c．Jun的磷酸化被认为是低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡的必要条件。c．Jun氨基末端激酶(JNK)和p38都可能是c-Jun的激酶，但究竟是JNK还是p38亦或是二者均介导低钾诱导的c．Jtm磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡仍然不清楚。月￡研究／以JNK抑制剂SP600125及p38抑制剂SB239063为主要工具，采

3、用免疫印迹、基因转染、免疫共沉淀、激酶分析等技术从细胞水平、分子水平探讨究竟是JNK，还是p38亦或是二者均介导低钾诱导的c．Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡，可望能为确立防治神经退行性疾病的药物开发新靶点提供线索。r~。／方法：l、小脑颗粒神经元的原代培养：相差显微镜观察细胞形态；Hoechst33258荧光素核染色观察神经元核形态、检测存活率：基因转染研究基因功能；蛋白免疫印迹法检测JNK、p38和c-Jun磷酸化水平的变化；免疫共沉淀检测p38活性：激酶分析检测SP600125及SB239063的特异性。中山大学硕士论文JNK与p38介导

4、低钾诱导的c-Jun磷酸化及小脑颗粒神经元嗣亡结果：1．低钾诱导了c．Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡1．1用特异的抗c·Junser73位磷酸化抗体进行免疫印迹，结果显示低钾处理后小脑颗粒神经元c．Jun磷酸化水平持续升高。1．2Hoechst33258核染色表明，低钾处理后24h，小脑颗粒神经元细胞核明显固缩，形成典型的凋亡小体。2．c—Jun的转录活性是小脑颗粒神经元凋亡所必需。转染负显性的争Jun(Ad—DN．c-Jun)可抑制低钾诱导的神经元核固缩。3．JNK介导了低钾诱导的c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡3．1低钾时JNK的磷酸

5、化水平掉舅毋星罨蜒变。3．2JNK抑制剂SP600125在0uM～20uM间浓度依赖地抑制低钾诱导的c-Jun磷酸化和神经元核固缩。3．3体外激酶分析检验SP600125的特异性：SP600125抑制JNK磷酸化e-Jun和ATF2，而不抑制p38磷酸化ATF2。4．p38也介导了低钾诱导的c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡4．1低钾处理后，p38的磷酸化水平持续升高。4．2p38抑制剂SB239063在0l-tM～1OuM间浓度依赖地抑制低钾诱导的c—Jun磷酸化和神经元核固缩。4．3体外激酶分析检验SB239063的特异性，结果显示SB2

6、39063仅抑制p38磷酸化ATF2，而不抑制JNK磷酸化ATF2。4．4特异的抗磷酸化p38抗体免疫沉淀复合物可磷酸化c．Jun，此磷酸化可被JNK抑制剂SP600125抑制，而不能被p38抑制剂SB23903抑制。5．c-Jun是JNK，而不是p38的底物。体外激酶分析结果显示JNK能直接磷酸化c。Jun，而p38不能。^，夕／／～结论：1．JNK直接介导低钾诱导的小脑颗粒神经元c—Jun磷酸化。2．p38间接介导低钾诱导的小脑颗粒神经元c．Jun磷酸化。3．JNK和p38均介导低钾诱导的c-Jun磷酸化和小脑颗粒神经元凋亡。关键词：小脑颗

7、粒神经元；《g眵JNK；p38；c．Jun}Lo、＼II中山大学硕士论文．INK与p38介导低钾诱导的c-Jun磷酸化及小脑颗粒神经元凋亡BothJNKandp38RegulateLowPotassium-inducedc-JunPhosphorylationandApoptosisinCulturedCerebellarGranuleNeuronsMajor：Biochemistrylostgraduate：XieYuanbinSupervisor：Prof．ZhuZhenyu，AssociateProf．LiMiralgtaoAbstrac

8、tCerebellargranuleneurons(CGNs)constitutethemostabundantcentralneuronalpopu