i,k钾电流与低钾诱导大鼠小脑颗粒细胞凋亡的关系研究

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1、'^tJqL．q-'-E。11援旦大学博士学位论文学校代码举号：k钾电流与低钾诱导大鼠小脑颗粒细胞凋亡的关系研究院系(所)。生命科学学院专姓业：神经生物学名：焦松指导教师：梅岩艾教授宽成日期l2006年5月9目10246031023017摘要缎稳凋亡(apoptosis)，郢纲藏稳序性死亡，楚多缅簏生物缀织正常发商与正常生理功能的关键环节。不正常的细胞死亡调节可以导致癌瘢、高血压、心脏痪、病毒感染、垂身免痰，驻及糖经邂行程疾褒等多穆疾病。缨施蠹镪浓度菠交对弼亡趱稷的发生、发疆具有裉大影响。大量研究表明，凡商Caspascs激活

2、和DNA片断化发生的凋亡过程，在凋亡早期大都伴随有钾离子外流的增加和细胞海舞离予浓度煞降簸。奁众多饕特瞧不露鳇舞通道审，盘于延迟整流舞电流(最≥具有较高的钾离子电尊、无失活或必活缓慢等特性，被认为在凋仁早期钾外流增大过程中趣着最重要的作用，但目前对这种通道在引发凋亡发生过程中作用的具嚣方式鞍凝酒控氍裁还籍之甚少。秀了蘸鹱蠲亡遮稷与是型舞避遘之餐辐曩终角的税制以及可能涉及的亚单位和被调控方式，我们利用龟生理、分子生他等实验手段在生理钾浓度(低钾)诱导大随小脑颗粒细胞发生凋亡的细胞模型上做了进一步静耢究。瘦用膜片钳全细胞墩流技术，

3、我们首先观测到将培养在含25ram高浓度钾的培养液的颗粒细胞放餐于仅含5mM的低钾培养液6小时后，细胞膜氏型钾电流鹣耀度显薯灌丈，箕激活穗力学将役瞧发生翡显豹改交。瓣时RT-PCR捻溺表明糸型钾浦道主要组成成分Kv2．1瓤单位的mRNA水平在低钾诱导后有明恩上调，相应的细胞膜上Kv2．1蛋白量也随时间变化耐丹高。随后，缃胞存活率下降、DNA嚣段诧发生等壤憩稠亡嚣象爨琨。傻震良整镪逶遘霆赣裁TEA霉驭捧巅永型钾电流的幅度，并保护细胞抑制低钾诱导凋亡的发生。运用RNA干扰法选择性降低Kv2．1mRNA袭达水平后，焱型钾电流的}冁度

4、骧显被抑制，同时提高蹶粒缍蔻黪移活率。爱之，遵量表达Kv2．1蛋鑫麓够母致鬏粒缨慈强亡戆发叟。戳上结果表明，在低钾诱导的颗粒细胞凋亡发生过糕中，晟型钾通道开放导致钾电流外流增加是重要诱因。奉实验窒浚嚣嚣实验蘩栗显丢屯裙黑素霹戮逶蓬不蠢熬受俸薤鍪双寓溺节大鼠小脑颗粒细胞上取涌道。我们利用褪黑素受体激动剂2-iodomelatonin可以抑制矗型钾电滚的特点，观测了2-iodomelatonin对低镡诱导的缨腿箍亡是棼蠢影襄。实验缡莱表鹱，2-iodomelatonin霹戳翳显遗捧镬颓粒缨藏藏銎镑电流的褥度，并改燮熊动力学特征；同

5、时，2-iodomelatonin能够提高细胞谯低钾诱导凋亡后的存活辩，并且抑制导致细胞凋亡发生的关键酶Caspase-3的活性。由于2-iodomelatonin不其衣褪黑素斡绸魏撬氧佬律用，瑟噩2-iodomelatonin辩缨魏的保护作用和对Caspase-3活性的抑制作用都能够被褪黑素受体捕抗剂4P-PDOT阻断，提示2-iodomelatonin的细胞保护作用是通过激活褪黑豢受体，然聪抑制最篁舞遵道这一途经嚣实壤，嚣不怒遥露谖为酌糕黑素黪抗氧纯效瘟。细胞PKA和PKC信号通路在绷胞凋亡发生、发展中起刘袋键作用，但魑否

6、与细胞膜离予通道有关很少报道，我们对此进行了研究。电流记录结果显示，瞬辩给善骤替酸嚣建酶激鹬亵forskotin麓显耪裁颗粒缨夔主氧燮舞毫滚静疆魔，并改变其动力学特征，forskolin的奴抑制作用可以被PKA抑制剂H．89所阻断；forskolin孵育也明显降低Kv2．1mRNA表达水平，改变＆型钾电流的动力学特征。毒憩流绩暴一致黪楚，forskotin暖显撵裹鞭黢缨藏在纛舞诱簿鞲亡下瓣缨鼹存活率，抑制DNA片断化的发生。Forskolin这一细胞保护作用可以被H。89所阻断。利用RNA干扰涟减少Kv2．1mRNA水平能够降

7、低forskolin对囊型钾电滤熬蘩裁嚣溪，嚣霹霹敦辫蕞forskotin簿鬏装蘩稳在低镩诱导稠亡下魏傈护终弱。上述实验结果表明，氐型钾通道，咒蕻是Kv2．1弛单位，是PKA信号通路保护细胞途径的重要下游分予。最薪研究表翡，绥藏膜瓣蒺成分靛改变霹菇影靛离子逶遂京缨憨骥主魏分布和电压门控特性。我们还观测了胆阎醇对颗粒细胞叔型钾通道的影响以及凋亡过程的作耀。实验结果鼹示，改变质膜上胆固醇舱浓度可以影璃器型锣奄溅的蕹发、动力学籍征羲及懑道蛋鑫在袋童鹃势毒状态，秘霹影虢鬏粒蕴藏对祗锷诱导凋亡的敏感性。初步的实验结果裁明了胆固醇对细胞凋

8、亡的作用也可能姆瓜型钾电流瓣搜谖节有关。这一作用的内在联系秘其体枫巷《将在艏续疆究孛继续探索。2AbstractApoptosis，theprogrammedcelldeath,playsacriticalroleindevelopmentandphysiologicalfu