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1、首都师范大学学报(自然科学版)第28卷第4期JournalofCapitalNormalUniversityNo.82007年8月(NaturalScienceEdition)Aug.,2007烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究11122黄静赵琦李楠赵玉锦张世煌(1首都师范大学生命科学学院,北京100037;2中国农科院作物科学研究所玉米研究中心,北京100081)摘要本试验以烟草叶片和烟草悬浮系制备的原生质体为材料,采用不同染料对原生质体活力和细胞核进行染色效果比较.结果表明,原生质体活力观察宜采用荧光素双醋酸酯(FDA)染色法,染色效果清晰易于观察,四嘧唑蓝(MT
2、T)法则可定量反映原生质体活力;相对于其他细胞核染料,DAPI对不同来源的原生质体细胞核染色效果均较好,能够清晰地对原生质体进行观察和计数.本研究为今后原生质体的检测提供有用的参考.关键词:烟草,原生质体,细胞核,染色.中图分类号:Q94215原生质体(protoplast)是去除细胞壁,由质膜包FDA储存液为2mg/L丙酮溶液,4℃保存,工作裹的裸露细胞.由于原生质体失去了细胞壁这一屏液浓度为0101%;台盼兰用磷酸缓冲液PBS(NaCl障,因而使其具有特殊的优点,不仅可作为一个单细8100g/L,KCl0.20g/L,NA2HPO4·12H2O2189g/L,胞系统用于细
3、胞壁再生、膜的透性及离子转运、细胞NAH2PO40120g/L,pH714)配制为014%的工作液保分裂与分化、细胞器摄入、病毒侵染机理等基础理论存.吸取纯化的原生质体悬浮液015mL于1mL试的研究,同时还是原生质体培养和原生质体融合的管中,加入染料混匀,避光置室温5min,台盼兰用[1]基础.PBS清洗2次后在明视野显微镜下观察;FDA用荧目前植物细胞电融合技术不仅是植物遗传改良光显微镜中蓝色激发块(B激发)直接观察.[2]的重要手段,也是空间发展的生物技术之一.确定11212四嘧唑蓝(Thiazolylblue,MTT)染色法一套简便,准确的方法来研究原生质体活力及细胞
4、用磷酸缓冲液PBS配制5mg/mLMTT溶液,核计数方法,对于观察原生质体的电融合具有十分0122μm微孔滤器除菌,4℃保存,两周内有效.纯化重要的意义.本试验以烟草叶片和烟草悬浮系制备的原生质体悬浮液中加入40μL的MTT染液,28℃的原生质体为材料,采用不同染料对两种原生质体避光保温4h,吸弃上清液,加入150μLDMSO,振荡活力及细胞核计数方法进行了分析与比较,为今后10min,使结晶物充分溶解,酶联免疫仪490nm进行原生质体的检测提供有用的参考.检测.1材料与方法113原生质体细胞核计数11311罗丹明B(RhodamineB)染色111材料配制011mg/mL罗
5、丹明B水溶液保存备用.使烟草无菌苗(Nicotianatabacumcv.Wisconsin用时用017mol甘露醇溶液稀释10倍,吸取纯化的38)叶片和烟草悬浮系(T2BY22)为材料游离纯化得原生质体悬浮液015mL和100μL稀释染料于1mL到的原生质体.试管中混匀,室温避光放置5min,用017mol甘露醇112原生质体活力测定溶液清洗2次,显微镜下观察.11211荧光素双醋酸酯(FDA)和台盼兰染色法11312苏木精染色本试验采用的是Carazzi苏木素染液.115g苏木收稿日期:2006209204素用5mL无水乙醇溶解,400mL蒸馏水溶解20g42第4期黄静等
6、:烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究硫酸铝钾(加温至90℃,勿煮沸),将溶解的苏木素显微镜弱蓝光紫外(U激发)激发块观察.和碘酸钠同时加入硫酸铝钾水溶液中,流水冷却至2结果与分析室温,再加100mL甘油,振荡1h,染液可保存6个月.211原生质体活力测定将纯化的原生质体悬浮液015mL和100μL苏21111FDA染色和台盼兰染色木素染液置1mL试管中混匀,染色2min,用017molFDA染色后发黄绿色荧光的原生质体为有活力[3]甘露醇溶液清洗2次,在明视野显微镜下观察.的,红色荧光(叶绿素产生)则表示死亡.荧光显微11313吖啶橙(AcridineOrange,A
7、0)染色镜下观察到大部分烟草原生质体发黄绿色荧光,只用蒸馏水配制成011%的吖啶橙储存液,置棕有少数原生质体发红色荧光,染色清晰.色瓶4℃保存备用.用前1mL吖啶橙储存液加台盼兰染液能够通过死亡细胞膜而使死细胞染pH418磷酸缓冲液9mL,配制成0101%吖啶橙酸染成蓝色,但染料不能透过活细胞,因此活细胞不被着液.在纯化的原生质体中加入95%乙醇固定15～30色.明视野显微镜下可以看到有活力的烟草叶片原min,用pH418磷酸盐缓冲液清洗;再加入0101%的生质体未被染色,为淡绿色,而失去内涵物的原生质
