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1、广东巨大儿发病率调查及高危因素分析【关键词】广东巨大儿发病率高危因素 A:ImmunohistochemicalstainingwithantiinsulinantibodyofisletgraftsinMSCgrouponday15aftertransplantation;B:Immunohistochemicalstainingwithantiinsulinantibodyofisletgraftsincontrolgrouponday15aftertransplantation;C:Immunohistoche
2、micalstainingwithanti-CD40LIgantibodyofisletgraftsinMSCinfectedwithCD40LIggenegrouponday30aftertransplantation;SP,originalmagnification×200 在前期研究中,我们利用羊膜建立诱导体系将小鼠胚胎干细胞定向诱导为表皮样细胞(epidermal-likecells,ELC),形态学上呈现典型的表皮样单层细胞,免疫组化染色显示,分化后的ELC表达表皮特异标志物β1整合素(β1-integri
3、n)?角蛋白19(cytokeratin,13CK19)和角蛋白15(CK15)[1]?将已诱导的胚胎干细胞植入裸鼠皮下获得的瘤体进行病理切片,可见大量表皮样和表皮附属器样结构?这表明羊膜诱导体系能够将胚胎干细胞诱导为表皮细胞,诱导后的细胞具有分化为表皮及表皮附属器的潜能[2]?但从胚胎干细胞分化为ELC的过程中,基因表达谱系的时空变化?起关键作用的信号通路以及相关的表观遗传学调控机制等尚不清楚?本研究先行从全基因组表达芯片分析入手,筛选出分化前后发生显著差异表达的基因,通过基因本体(geneontology,GO)分
4、析和通路(pathway)分析方法初步明确这些差异表达基因的大体分类和参与的信号通路,为进一步寻找决定分化方向的关键基因及其调控机制奠定基础? 1材料与方法 1.1材料 ES-BALB/c小鼠胚胎干细胞(中山大学附属眼科中心黄冰教授惠赠)?滤膜孔径为3μm的双层6孔培养板(Transwell),购于Costar公司?DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)?小鼠白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)胰蛋白酶和胎牛血清均为Gibco公司产品;TR
5、IZOL为InvitrogenLifeTechnologies公司产品;氯仿为上海化学试剂有限公司产品;异丙醇为上海化学试剂有限公司产品;无水乙醇为上海化学试剂有限公司产品;InvitrogenSuperscript双链cDNA合成试剂盒为Invitrogen产品;单标DNA试剂盒?杂交系统4均为NimbleGen公司产品? 1.2方法13 1.2.1〓羊膜制备〓取足月妊娠剖腹产的胎膜,钝性分离除去绒毛膜,用含庆大霉素的生理盐水反复冲洗,去除血污,剪切成大小约为3mm×5mm方形,浸泡于ESC培养液中备用? 1.
6、2.2〓ESC体外诱导分化〓取传代培养48h的ES-BALB/c细胞,以1.25g/L胰蛋白酶-EDTA消化液消化,按5×108cells/L接种于双层6孔培养板的下层,然后将制备好的羊膜置于双层培养板的上层,用无LIFESC培养液培养?每隔24h将培养液换掉一半,培养3d,倒置镜下观察细胞形态变化? 1.2.3〓RNA抽提〓TRIZOL法提取小鼠的ESC及诱导后的ELC的总RNA,将1mLTRIZOL试剂直接加入6孔板中反复吸充分裂解细胞;酚氯仿两相分离,RNA全部分配在水相,将水相转移异丙醇沉淀RNA,离心收集,
7、去上清;每1mLTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1mL的750mL/L乙醇,清洗RNA沉淀,振荡离心;去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5~10min,加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后55到60℃孵育10min?获得的RNA溶液保存于-70℃;紫外吸收测定法测定RNA的纯度及浓度;变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度? 1.2.4〓cDNA的合成与样本荧光标记〓双链cDNA的合成采用InvitrogenSuperscript双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen,11917-020)提供步骤合成cD
8、NA,以总RNA平为模板,采用OligodTPrimer反转第一链,T4DNA聚合酶系统合成第二链cDNA;用RNaseA13消化掉多余的RNA残留;采用NimbleGen单标kit,Cy3-RandomNonamers标记,标记产物根据浓度,计算每管Cy3标记的样本的量,并参照“RNA_cDNA_LabeledDNA-QC”指控
