重型肝炎血清的蛋白质指纹图谱研究

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1、浙江大学博士学位论文重型肝炎血清的蛋白质指纹图谱研究姓名：刘小丽申请学位级别：博士专业：内科学（传染病学）指导教师：李兰娟20050501浙江大学博士研究生学位论文中文摘要我国是病毒性肝炎的高发区，由肝炎病毒引起的以肝功能衰竭为主要特征的重型肝炎发病率很高。重型肝炎通常表现为肝细胞的大面积变性、坏死，最终使肝脏诸多功能丧失殆尽，引起极严重的临床后果。探索重型肝炎的病理生理、新的药物和治疗措施以提高疗效，是未来较长时间内国内外肝病研究的重点之一。目前已知，重型肝炎患者的临床表现与体内存在严重的蛋白合成障碍、代谢紊乱以及有毒物质的积聚有关。肝性脑病的发生与氨、芳香氨基酸、脂

2、肪酸(主要为短链脂肪酸)、硫醇、内源性苯二氮卓类物质、酚类、假性神经递质、Y一氨基丁酸(GABA)等物质的异常升高密切相关。另外，早在30年前，通过色谱技术发现重型肝炎患者血清中有～些异常升高的峰，据推测，很可能是分子量在5000—500之间的多肽(即中分子物质)。除了内科药物治疗之外，以清除各种有害物质、代偿肝脏的代谢功能为目标的人工肝技术的出现，开辟了重型肝炎治疗的新途径，大大地降低了病死率(近年来，国内报道的重型肝炎死亡率为40～50％)，是目前治疗重型肝炎的一种重要组成部分。由于肝脏功能的复杂性，目前的人工肝系统尚不能完全替代严重病变的肝脏，许多方面的性能均有待

3、优化。深入研究重型肝炎的病理生理及各型人工肝的作用特点。是优化人工肝系统性能的基础。重型肝炎患者经内科药物及人工肝治疗，病情仍恶化的，要考虑进行紧急肝移植。目前，肝移植治疗急性肝功能衰竭的疗效确切，病死率可降至20％。然而，由于供肝来源很少，很多患者在等待肝移植期间发展为不可逆性脑部损伤或因多器官衰竭而死”。因此，如何准确判断重型肝炎的预后，对最大限度利用有限的医疗资源、实施有效治疗至关重要。SELDI—TOF—MS(SurfaceEnhancedLaserDesorptionIonization—Time0fF1ight—Massspectr鲫etry，表面增强激光解

4、吸离子化飞行时间质谱)技术，是随着蛋白质组学的兴起而出现的新技术。该技术的主体由蛋白质芯片、飞行时闻质谱仪和相关软件组成，其中，蛋白质芯片是该技术的核心。由于sEIDI-ToF—MS技术的高通量特点，能够反映被检样品中一定分子量范围的蛋白质全貌，所以应浙江大学博士研究生学位论立用SEIDI-ToF—Ms技术得到的质谱图也被称为蛋白质指纹图谱。SELDI_TOF-鼯的技术特点：(1)集蛋白质样品前处理、分离及检测分析过程于一体，可对血清及组织粗样品中的各种蛋白质进行直接检测。(2)特别适合于分析分子量20KDa以下的蛋白质，而这一范围是二维凝胶电泳的分析弱项。实际上，人类

5、血清中的低分子量蛋白质(1渊molecularweighthu翔anproteins)或多肽是一个被忽略的、有待开发的宝库，可被用于寻找发病机制的目标蛋白、早期诊断的生物标记物。近年来，随着sELDI—To卜MS技术在癌症、老年性痴呆、传染性疾病和心血管疾病研究等方面的应用，越来越多的令人瞩目的研究成果表明：人血清中的低分子量蛋白质或多肽变化可反映组织的病理生理状况信息，从而为疾病的监测提供有用的生物标记物。本研究目的：应用SELDI—TOF—MS技术平台，研究重型肝炎血清的蛋白质指纹图谱特点，为进一步探讨重型肝炎的病理生理打下基础；同时将所获得的血清蛋白质指纹图谱应用

6、于重型肝炎的预后预测。材料与方法1．材料·标本：76份血清标本——健康对照组22例，病毒性肝炎组54例(其中重型肝炎28例。●设备：SELDI-TO卜MS仪(Ciphergeninc．美国)，设置最高分子量为20，ooODa，最佳状态从1，ooODa到10，OooDa。●芯片：QlO芯片(为强阴离子芯片)、骶x芯片(弱阳离子芯片)、IMAc芯片(金属亲和芯片)、H4芯片(疏水芯片)。●数据分析工具软件45称：Proteinchipsoft-are3．1，Biomarkerwizard(ciphergeninc．美国)：收集蛋白质质谱数据；软件名称：SPSs11．0软件包

7、(SPsSInc．美国)，用于t检验、相关性分析。软件名称：^lATLAB6．5(TheM8thworksInc．美国)，用于模式识别分析(主成分分析、判别式偏最小二乘法、人工神经网络)2．方法浙江大学博士研究生学位论文·通过对比重型肝炎血清、血浆的蛋白质指纹图谱以及比较不同芯片的蛋白质指纹图谱，筛选出适合本研究的样品和芯片种类。·对54例不同程度肝功能损害的慢性乙型肝炎赢清进行蛋白质指纹图谱研究，选综合性指标^IELD分数评价肝功能，应用Spearman相关性分析方法，分析各峰的强度与吼D分数的相关性。●对比22例健康对照组与28例慢性