痰瘀证的血清蛋白质指纹图谱的临床研究

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1、痰瘀证的血清蛋白质指纹图谱的临床研究【摘要】［目的］分析痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱，探讨痰瘀证患者血清多肽蛋白表达的差异性。［方法］应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDITOFMS）及弱阳离子交换蛋白质芯片（albuminfingerprintspectrumofsputumstasissyndromeandexplorethedisparityofitspolypeptidealbuminexpressions.［Method］ApplySELDITOFMSandalpersons’serumforfingerprintspectrum.［Result］Th

2、ere’re18kindsofdisparityalbuminbetalpersons.［Conclusion］Sputumstasispatientshavesomedifferentexpressedalbumininserum.　　Keystasissyndrome；albumin；fingerprintspectrum所谓“证”，是指在疾病发展过程中，某一阶段的病理概括。它包括病的原因（如风寒、瘀血、痰饮等等）、病的部位（如表、里、某脏、某腑等等）、病的性质（如寒、热等等），反映了疾病过程中该阶段病理变化的全面情况。笔者应用SELDITOFMS及蛋白质芯片技术从蛋白质指

3、纹图谱角度探讨痰瘀证本质及发病机制。　　1资料与方法　　1.1临床资料　　14例为2008年1月至2008年12月浙江省人民医院中医科门诊病人，诊断标准根据《中医诊断学》中关于痰证和瘀证的诊断标准拟定，主要以舌象的舌质紫暗、舌苔滑腻和脉象的脉涩为诊断依据。其中男13例，女1例；年龄25～69岁，平均（47）岁。选择16例正常健康人为对照组，其中男15例，女1例；年龄28～65岁，平均（46.5）岁。2组年龄、性别等资料经统计学处理无显著性差异，具有可比性。　　1.２材料和方法　　（1）材料：尿素、乙腈、三氟乙酸、TrisHClpH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLCH2

4、O和sinapinicacid（SPA）等均购自Sigma公司。（2）方法：①血清标本处理：14例痰瘀证患者和16例正常健康人各空腹采集静脉血3ml，采集后立即于4℃低温冰箱静置2h，4℃，4000r/min离心10min分离血清，将血清于4℃，12000r/min再次离心5min，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为每管100μl，保存于-80℃冰箱。实验检测血清均仅一次冻融。从-80℃冰箱中取出血清样品，于4℃，10000r/min，离心5min；取血清10μl，加入20μlU9缓冲液（9MUrea，2%CHAPS，50mMTrisHCl，pH9.0）稀释，而后，

5、将以上标本冰浴振荡30min，400r/min；将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结合缓冲液混匀，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。②NaAc，Ph4.0）加至已装好S1Minishaker）400～600r/min震荡5min，甩掉缓冲液。重复上述操作两次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的标本，置振荡器400～600r/min，4℃震荡1h；甩出标本。每孔加入200μl结合缓冲液，室温置振荡器400～600r/min，震荡5min，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。立刻拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，在每个加样孔上加SPA0.

6、5μl，干燥后再重复加SPA0.5μl一次，然后用蛋白质指纹图谱仪（SELDITOFMS，美国Ciphergen公司）阅读芯片。③蛋白质指纹图谱的测定参数和标化：在读取数据前，用加有allinone标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子误差<0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定：最佳激光强度240，最佳检测灵敏度8；设最高检测分子质量为50Da，最佳状态从1Da到15000Da；蛋白质指纹图谱的标化参数：蛋白峰范围质荷比（m/z）2000～45000；m/z为6634.8的蛋白为所有蛋白谱的共有蛋白，作为校正的内参照。　　1.３统计学处理　　蛋白质指纹图谱统计用

7、CiphergenProteinChip软件，数据输入计算机，两样本总体方差齐同时，两样本均数用t检验；两样本总体方差不齐同时，两样本均数用近似t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。　　2实验结果14例痰瘀证患者血清蛋白质指纹图谱建立后，在（m/z）2000～45000Da范围内，与正常对照组比较，共检测出18种差异表达蛋白（P<0.05），m/z为2757、4477、6635、6885、7976、8694、8898、8943、13749、13956和