RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响

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1、西南大学博士学位论文RNAi介导的Lcy基因沉默对番茄果实中番茄红素含量的影响姓名：万群申请学位级别：博士专业：园艺学指导教师：张兴国;宋明20070401西南大学博十学位论文根据GenBank中公布的番茄Pds启动子序列(U46919)设计特异引物，从番茄基因组中分离了长1790bp的,ads启动子序列．测序结果表明所分离的Pds启动子序列和GenBank中公布的一致。通过SalI和毖棚I酶切将全长Pds启动子插入到pVCT一2020表达载体中，替换掉该载体中GUS基因的35S启动子，构建成携有Pds-GUS基因表达盒的植物基因表达载体。通过农杆菌介导的

2、转基因方法将Pds-GUS基因转入番茄中，获得的转基因番茄的果实j叶片及根经X-Gluc染色5h，70％乙醇脱色后，显微镜下观察照相。结果表明Pds启动子具有果实特异性的特点．2．番茄红素环化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根据GenBank中公布的番茄红素13环化酶基因(Lcy-P)序列0【86452)设计特异引物，上游引物P166：cTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGcTcGATGc从cTC嚣CTrCTCTA，通过PcR从番茄基因组中获得了长302bp的Lcy片段，测序结果表明与GenBank公布的一致。3．果实特异性

3、RNAi的植物表达载体的构建通过Sa]I酶切，补平，再用Bali酶切后连接，得到Lcy片段反向重复连接的中间克隆载体p∞一srLcy。将pMD-srLcy经胁lI酶切，去磷酸化后与内含子连接，构建RNAi片段的中间克隆载体pMD-RNAi。pMD-RNAi经妇，I和ECll36II切下RNAi片段插入到pVCT2020载体中，构建成pvCT—RNAi表达载体。pMn—Pds经SalI和＆胡I切下Pds启动子后，将Pds片段插入到SalI和EcogI酶切的pVCT—RNAi载体中，构建成pVCT-PdsRNAi载体。构建成的pVCT—PdsRNAi表达载体经

4、酶切鉴定，能获得正确的目的带，表明构建的载体正确。4．番茄遗传转化再生体系的建立番茄种子经肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水冲洗掉乙醇；然后在超净台上用10％的次氯酸钠消毒30min，灭菌水漂洗4次后。接种于l／2惦培养基上，暗培养2～3天，待番茄种子发芽后，于25℃，光照强度18001x，16h光／8h暗的光周期条件下培养直到子叶完全展开。切取番茄的子叶和下胚轴，分别接种到惦+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LIAA+3％蔗糖+6．5％琼脂的固体培养基上，比较子叶和下胚轴的芽分化能力，结果表明子叶的芽分化能力高于下胚轴。将番茄子叶接种

5、到IIs附加不同浓度6一队(1～3mg／L)与IAA(O．1～O．3mg／L)及6一BA(1～3mg／L)与NAA(0．1～O．3mg／L)组合的培养基上，筛选适宜芽分化的激素浓度及最佳组合。结果表明在MS+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LI从+3％蔗糖+6．5％琼脂的培养基上番茄子叶的芽诱导率最高，并且诱导芽所需要的时间最短，长出的芽最壮，因此本实验最终采用MS+1．0mWL6-BA+0．2mg／LIAA+3％蔗糖+6．5％琼脂组合的培养基来诱导番茄子叶发芽。设计不同浓度的IAA(0．2～0．5mg／L)。观察不定芽生根的速度、数量及生根的质量，以

6、确定适丁二番茄生根的最佳IAA浓度，结果显示幼苗在不同培养基中都能生根，其中以含0．4mg／LIAA的培养基生根最快，一周后即出现大鼍不定根，根系比较壮。II摘要为了测定外植体对Kan的敏感性，在筛选的最佳诱导培养基中，加入不同浓度的kan(O、10、20、30，40，50、60、70mg／L)测定外植体的分化情况，每个浓度3次重复，每次重复20个外植体，接种观察不同浓度kan对番茄子叶分化抑制的效果。结果表明当在浓度为60mg／L的培养基上，有少量愈伤组织形成，以后逐渐白化、死去，不能分化出芽；含40mg／Lkan．的培养基上多数外植体形成较多的愈伤组织

7、，大部分可分化出绿芽，并且生长正常；因此本实验所用番茄材料适宜的筛选压为kan50mg／L．5．转基因番茄的获得采用农杆菌介导法，将携带pVCT-PdsRNAi表达载体的新鲜的农杆菌菌液用液体Ms培养基重悬后，浸染已经在分化培养基上预培养两天的番茄子叶，将经农杆菌浸染的外植体接种到芽诱导培养基(MS+1．0mg／L6-BA+0．2mg／LI从+309／L蔗糖+琼脂6．59／L)上28"C暗培养2d，然后将外植体转入抑菌培养基(MS+1．0mg／L6-队+0．2mg／kIAA+30g／L蔗糖+300mg／L羧卞青霉素cb，pH5．8)上培养7天，然后把抑菌培

8、养7d后的外植体转移到选择培养基(MS+1．omg／L6一卧+0．