冠心病患者冬眠心肌中TNFα表达及细胞凋亡的临床研究

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1、冠心病患者冬眠心肌中TNF-α表达及细胞凋亡的临床研究作者：李东野钱文浩於江泉夏勇潘德锋孙全胜张中明【摘要】目的探讨冬眠心肌细胞内TNF-αmRNA与心肌细胞凋亡的变化和意义，初步探索冬眠心肌形成的分子生物学机制。方法行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者10例，术前1周内用多巴酚丁胺超声负荷试验（DSE）结合多普勒组织成像(DTI)确定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG术中根据检测结果进行取材（分别取正常心肌和冬眠心肌），并经电镜证实。取材心肌用Tunel法检测心肌细胞凋亡情况，原位杂交法(I

2、SH)测定TNF-αmRNA的活性。分析TNF-αmRNA与心肌细胞凋亡的关系。结果冬眠心肌细胞凋亡数及TNF-αmRNA的表达较正常细胞高；TNF-αmRNA与冬眠心肌细胞凋亡数相关（r＝0.816，P＜0.05）。结论心肌缺血缺氧时，心肌细胞内TNF-α分泌增加，TNF-α促进冬眠心肌的形成并诱导心肌细胞凋亡。【关键词】冬眠心肌；肿瘤坏死因子α；分子生物学机制心肌冬眠(hibernatingmyocardium，HM)是心脏自动适应心肌慢性低灌注的一种反应，此时心肌灌注和心肌功能之间达到一种新的平衡

3、。HM已成为近年来冠心病研究领域的热点之一，但迄今HM形成的确切机制尚不完全清楚。有研究发现，HM局部收缩功能与肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)高表达呈负相关［1］，TNF-7а的高表达可以促进动物心肌细胞凋亡。TNF-α的表达与冠心病患者HM凋亡之间的关系鲜见报道。本研究观察冠心病患者HM细胞的TNF-αmRNA表达，同时观察HM细胞凋亡情况。1材料和方法1.1实验材料TNF-αmRNA原位杂交试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自武汉博士德生物公司。冠心病患者的心肌标本由

4、徐州医学院附属医院胸心外科协助取材。1.2心肌标本来源10例心肌标本均来自2004年8月—2006年3月在我院胸心外科行冠状动脉搭桥手术（CABG）的冠心病患者，冠状动脉造影至少有1支冠状动脉狭窄程度大于85%。男性7例，女性3例，平均年龄（58.3±4.24）岁。术中取HM及正常心肌（normalmyocardium，NM）。1.3HM定位1.3.1采用多巴酚丁胺超声负荷试验(DSE)结合组织多普勒成像（DTI）技术。将左心室按美国超声心动图协会方法分为相对应的16个节段。1.3.2DSE检查方案试验

5、分为静息、多巴酚丁胺10μg/(kg·min)、30μg/(kg·min)3个级别，每级负荷维持5min，于每级负荷时记录超声图像，并记录常规12导联ECG和血压；终止指标为：出现心绞痛；收缩压<80mmHg或≥220mmHg（1mmHg＝0.133kPa）；出现严重心律失常；心率达到该患者年龄估算最高心率的85%；同一节段运动出现双相反应。71.3.3室壁节段运动异常的判定DTI测量心肌收缩期峰值平均运动速度。如静息时平均运动速度低于正常速度，负荷10μg/(kg·min)多巴酚丁胺时心肌运动速

6、度较静息时明显增高，负荷30μg/(kg·min)多巴酚丁胺时心肌运动速度反而减低，此时定义心肌运动呈双相反应，判定为HM。1.4心肌处理4%戊二醛、10%甲醛（含0.1%焦碳酸二乙酯，DEPC）固定，在电子显微镜观察确认后分别进行ISH、Tunel试验。ISH法测TNF-αmRNA，Tunel法检测细胞凋亡。原位杂交及Tunel法均按试剂说明书进行操作。原位杂交探针序列为：（1）5′-GAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGA-3′（2）5′-GAGTGACAAGCCTGTAGCCC

7、ATGTTGTAGC-3′（3）5′-GGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTG-3′1.5统计学处理计量数据以±s表示，统计软件采用SPSS13.0，统计方法采用配对t检验。检验水准α＝0.05。2结果2.1病理结果电镜下(×127000)可见HM与NM比较有以下一些特点：心肌纤维数量减少、稀疏，心肌纤维数量减少主要集中在细胞核周围。心肌纤维数量减少时细胞容量无变化（这一点与细胞萎缩不同）；心肌细胞内出现糖原积淀；心肌细胞内线粒体体积变小，散在分布于胞质内；细胞核扭曲，可见散在的异染

8、色质；心肌细胞内没有发生小泡、水肿、染色体肿胀、细胞核崩解、脂质沉积等细胞坏死和萎缩时常见的变化。见图1A。2.2原位杂交结果HMTNF-αmRNA胞质着色成棕黄色（图1B），原位杂交用LeicaQwin图像分析仪测定平均灰度值。HM组TNF-α胞质平均灰度值明显高于NM组(P＜0.05)。见表1。2.3心肌凋亡细胞计数NM细胞核呈蓝色，而HM中凋亡心肌细胞核呈棕黄色（图1C）。在光学显微镜下计数5个高倍视野（HPF，×100）中凋亡阳性心