兔冬眠心肌模型骨髓干细胞动员及心肌组织中血管内皮生长因子的基因表达论文

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1、兔冬眠心肌模型骨髓干细胞动员及心肌组织中血管内皮生长因子的基因表达论文【摘要】目的:探讨兔冬眠心肌模型外周血骨髓干细胞的变化及缺血心肌组织中血管内皮生长因子基因表达的变化.方法:选用雄性日本大耳白兔为研究对象，通过开胸不全结扎冠状动脉左前降支方法建立冬眠心肌动物模型.将成功制备的24只兔模型随机分为4组，即缺血3d组、缺血7d组、缺血28d组和假手术对照组.应用流式细胞术测定各组模型动物外周血单个核细胞中CD34+细胞百分率，应用实时荧光定量PCR方法测定各组动物模型缺血心肌组织中血管内皮生长因子mRNA表达.结果:兔冬眠心肌模型于手术后出现骨髓干细胞动员，1RNA表达明显升高，随

2、时间延长表达逐渐降低.结论:冬眠心肌可通过组织局部血管内皮生长因子表达增高而动员骨髓干细胞进入外周血.【关键词】心肌顿抑骨髓干细胞动员血管内皮生长因子0引言干细胞治疗缺血性心脏病在动物实验和小规模临床试验均取得了很大进展［1-2］.目前这方面的研究主要集中在两方面，即急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心衰.freelentas公司；SYBRExScriptTMRTPCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；Trizol购于Invitrogen公司.BeckmanCoulter公司流式细胞仪和美国BioRad公司iQ5型RealTimeP

3、CR仪分别由西安交通大学医学院实验中心和第一附属医院心内科提供.选用雄性日本大耳白兔30只，体质量2~3kg，购于西安交通大学医学院实验动物中心.实验前，实验动物在动物中心适应性喂养1g/kg）耳缘静脉麻醉.随后经耳缘静脉注射利多卡因（1mg/kg），以预防冠状动脉结扎过程中发生室性心律失常.将兔仰卧位固定于手术台上，备皮，沿胸骨左缘剪断左侧第3~4肋软骨，暴露纵隔和心脏，保持两侧胸膜完整，距左冠状动脉冠状窦开口4~5mm处，用50无损伤带针缝合线穿过左前降支下方，将直径分别为0.8mm和0.1mm的粗、细丝线各一根置于左前降支前缘，将丝线与左前降支一起结扎，随后迅速抽出细丝线，

4、相当于血管90%狭窄.观察左前降支远端血管充盈不明显，左心室前壁和心尖部心肌颜色稍变暗，表明结扎成功.假手术组将缝合线穿过左前降支下方，但不结扎.术后常规饲养，肌肉注射青霉素（40万U/只）3d预防感染.术中及术后2d内共死亡6只，均为模型组，原因为气胸和失血过多.术后第3d对实验兔行超声心动图检查，观察左室前壁出现节段性运动障碍，未出现心肌梗死征象，提示手术成功.将存活的24只兔随机分为缺血3d组，缺血7d组、缺血28d组和假手术组，每组6只.1.2.2外周血单个核细胞中CD34+百分率测定各组每只兔耳缘静脉取血5mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞.取2×106

5、个细胞，分别加入10μLCD34单克隆抗体和荧光素藻红蛋白标记（阴性对照），室温避光孵育20min，用流式细胞仪检测外周血中CD34+细胞百分率.1.2.3缺血心肌组织中VEGFmRNA表达(1)引物设计：根据美国国立图书馆基因数据库(Genebank)检索VEGF基因序列，应用软件Primer5.0设计引物，由北京三博远志生物公司合成引物.VEGF上游引物为5′GGCAGAAGAAGGAGACAATAAACC3′，下游引物为5′CAGAGGCACGCAGGAAGG3′，产物大小361bp；管家基因βactin上游引物为5′CCATCTACGAGGGCTACGC3′，

6、下游引物为5′CGGCTGTGGTCACGAAGG3′，产物大小397bp.（2）标本采集和总RNA提取：各组每只兔按各自观察时间点处死，取出心脏，切取左室前壁缺血心肌迅速置于液氮中保存.取新鲜组织样品100mg剪碎，加入1mLTrizol裂解细胞，匀浆后进行总RNA的提取.对所有提取的总RNA进行紫外分光光度定量，测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，计算A260/A280值，均在1.8~2.0之间.（3）逆转录合成cDNA：参照逆转录试剂盒说明书进行.在20μL反应体系中分别加入：样本RNA模板0.5μg，随机六聚体引物(0.2g/L)1μL,加入去RNA

7、酶水至12μL,70℃孵育5min；然后加入5×反应缓冲液4μL,RNase抑制剂（20u/μL）1μL,10mmol/LdNTP混合液2μL，25℃孵育5min；最后加入RevertAidTMMMuLV反转录酶（200u/μL）1μL，总体积为20μL.混匀后置于下列条件反应：42℃60min，70℃10min，产物即为cDNA.（4）实时荧光定量PCR：反应体系在美国iQ5RealTimePCR仪上进行,采用25μL反应体系，其中含SYBRGREENPCRmix