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1、PCR质量控制 及常见问题分析、对策临床检验技术历经了一、化学试剂检验二、酶促生化检验三、抗原-抗体免疫反应等三个主要技术阶段四、近年来人类基因组计划的完成也推动了临床检验进入基因检测-分子诊断时代血糖检测一̖PCR技术最根本特征二̖PCR系统外的质量控制三̖PCR体系内的常见问题、原因分析及对策1.传统诊断:靶A+试剂B信号C,均为信号相加模式。2.PCR:1,2,4,8------230(109)---2n-----靶分子指数增加模式。PCR极高扩增放大倍数亦带来非特异性过度放大!1.硬件建设:2.软件控制:标准操作SOP,人员
2、操作培训,质量追踪体系。分室/分区实验室,安全柜,仪器,螺盖管/胶膜96孔板,PCR反应液加矿物油封闭,UDG酶消除气雾胶。PCR体系问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略临床PCR检测的常见问题实时荧光PCR定量检测的关键问题PCR体系内的常见问题、原因分析及其对策PCR标准反应体系DNA模板引物反应缓冲液Mg2＋浓度dNTPsdH2O耐热聚合酶反应体系对PCR扩增的影响DNA模板纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加引物特异性长度适当、避免二级
3、结构和二聚体PD完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少反应体系对PCR扩增的影响过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当避免反复冻融pH值适当避免污染pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂反应缓冲液dNTPsdH2OMg2＋浓度如何选择最合适的DNA聚合酶PCR用耐热DNA聚合酶Taq酶pfu酶HotstartTaq酶混合酶TaqplusLongTaqTaqplatinum特异性-----基因组扩增、RT-PCR保真性-----基因筛选、测序、克隆长片段扩增-----构建基因图谱、测序等扩增效率-----复杂
4、模板扩增（GC含量高、二级结构）PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测如何选择最合适的DNA聚合酶-----根据PCR实验需求PCR常见问题之一-----无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M12正对照原因模板含有抑制物，含量低引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间对策PCR常见问题之二-----非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大
5、或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因对策引物特异性差模板或引物浓度过高退火温度偏低循环次数过多重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数PCR常见问题之三-----拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态M12原因对策模板不纯退火温度偏低循环次数过多纯化模板适当提高退火温度减少循环次数PCR常见问题之四-----假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因靶序列或扩增产物的交叉污染对策操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，
6、所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。提高PCR反应特异性策略巢式PCR（Nest-PCR）递减PCR（TouchDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂策略之一巢式PCRPF1PR1PF2PR2巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。策略之二递减PCR递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨
7、的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三热启动PCR热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性
8、最基本的方法之一。策略之四使用PCR增强剂甲酰胺、DMSO、TMA、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当。实时荧光定量FQ-PCR通过实时
