《CR及质粒提取》PPT课件

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1、PCR技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程。实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs，TaqDNA聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作

2、。成分体积（µl）10×Buffer（Mg2+free）2.5MgCl2+（25mmol/L）1.5dNTPs（各2.5mmol/L）2引物11引物21Template1TaqDNA聚合酶（1U/µL）1dddH2O15PCR扩增反应体系：1.PCR扩增反应体系2.PCR扩增程序设置预变性94℃5'变性94℃30''退火60℃30''延伸72℃40"补充延伸72℃10'8℃保存30个循环碱裂解法提取质粒DNA质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的环状双链DNA。具有可自主复制、传给子代、也可丢

3、失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。作用：携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作用。基因克隆操作步骤（五字经）分——载体和目的基因的分离切——限制性内切酶的应用接——载体和目的基因拼接成重组体转——重组体的转化筛——DNA重组体筛选与鉴定质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的提取过程。实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各试剂的作用。实验原理：在碱性环境中，

4、细菌染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。1.将1.5ml过夜培养菌液放于EP管中，10000r/min离心1分钟，弃去上清液。2.加100μl溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5分钟。3.加200μl溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀4~6次，

5、室温放置5分钟。4.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰上放置10分钟。操作过程溶液I：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl，pH8.010mmol/LEDTA，pH8.0溶液II：0.2mol/LNaOH1%SDS溶液III：29.4g乙酸钾，11.5ml冰乙酸，H2O至100ml。5.12000r/m离心15分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。将上清液转移至EP管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次（12000r/min离

6、心10分钟）。6.吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12000r/min离心10分钟，沉淀DNA。7.70%乙醇洗涤沉淀2次，自然挥干。8.所得DNA溶于30~50μlTE中，-20℃保存备用。操作过程TE溶液：10mmol/LTris-Cl,pH8.01mmol/LEDTA,pH8.0实验要求：2人一组，思考实验过程中各种试剂的作用。