《质粒提取实验》PPT课件

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1、分子生物学实验重组DNA技术质粒DNA的提取琼脂糖凝胶电泳复制翻译转录不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。不同来源的DNA分子重组DNA分子重组DNA技术基本过程载体携带目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。作用：1、携带目的基因进入受体细胞2、使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。载体的特点1.对受体细胞无害，不影响受体细胞正常生命活动2.具有自主复制能力3.含有多克隆酶切位点4.携带标记基因、便于筛选5.除保留必要序列外，载体应尽可能小6.生物安全性好载体的类型质粒噬菌体病毒质粒存在于细

2、菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。第一次实验第二次实验第三次实验选切、连转筛质粒DNA的提取方法：碱裂解法原理：质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异将菌液转移至1.5ml离心管中(尽量倒满)↓12000rpm/30s（重复一次）弃上清扣干，加入SolutionⅠ100μL,剧烈振荡打散菌体，室温3min↓（以下操作要轻柔）加入新配制的SolutionⅡ200μL,温和颠倒离心管4～5次混匀，室温放置3min↓（此时出现拉丝现象）加入预冷的SolutionⅢ150μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，室温3min↓离心12000rpm/5mi

3、n具体步骤质粒DNA的上清400μL移至另一离心管中↓加等体积氯仿,轻微振荡↓离心12000rpm/2min转移上清液350μL至另一离心管↓加入2倍体积无水乙醇,轻轻混匀室温放置2min↓离心12000rpm/5min弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀↓离心12000rpm/2min（重复一次）弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干↓室温放置15min干燥加入TER40μL溶解质粒具体步骤SolutionI1、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。2、Tris-Cl：使溶液维持最适pH范围。3、EDTA：螯合掉Mg2+、C

4、a2+等二价金属离子，抑制DNA酶活性，防止其对DNA分子的降解作用。蔗糖+Tris+EDTASolutionII1.SDS：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性2.NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性SDS+NaOHSolutionIII1.中和溶液II的碱性，使DNA复性。2.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。KAc与HAc质粒的鉴定——琼脂糖凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。作

5、用：用于生物物质的分离分析用于分析物质的纯度和分子量的测定等电泳基本原理当粒子稳定运动时：F’=F即EQ=6πrηυυ/E表示电泳迁移率，即单位电场强度粒子的运动速度，以μ表示：μ=υ/E=Q/6πrη影响电泳的因素溶液的pH值电场强度缓冲液的离子强度电渗作用琼脂糖凝胶分离范围凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp）0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～2000实验流程注意事项1、制胶槽一定要放平2、倒胶时要慢，防止产生气泡1、与上样缓冲液、染液混匀2、避免产生

6、气泡3、小心防止戳破凝胶1、看准正负极2、确定电路联通再离开3、及时停止防止紫外线伤害