实验质粒提取.ppt

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1、质粒DNA的提取目的：学习和掌握SDS-碱裂解法提取质粒质粒（Plasmid)质粒是指在细菌染色体外，能自主复制和遗传的DNA分子，大多数是双链、闭合的超螺旋环形结构。自然界的质粒通常含有编码一些对宿主细胞有利的酶的基因，可以赋予宿主原先没有的性质，如抗生素抗性、产生一些化合物、细胞形态改变等。“超级细菌”大多数都是通过质粒获得抗生素抗性。参与细菌有性生殖的F因子，实际也是一种质粒，可以使细菌产生性菌毛并转移F因子。经过改造的质粒可用于DNA重组技术，通常具有抗生素和其他筛选标记、多克隆位点等。质粒在基因工程

2、中的应用分切接转筛表通过含葡萄糖、密度较高的溶液重悬携带质粒的细菌NaOH和十二烷基硫酸钠（SDS），共同作用裂解细胞NaOH为强碱，可使细胞膜的磷脂双分子层破裂，并能使DNA双链解链变性SDS为表面活性剂，可溶解细胞膜上的脂类使之破裂，并可通过疏水作用使蛋白质变性原理pH4.8的乙酸-乙酸钾缓冲液中的乙酸可中和NaOH，钾盐可与十二烷基硫酸钠反应生成不溶的十二烷基硫酸钾（PDS）沉淀NaOH被中和后，较小的质粒DNA可迅速复性，而基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构SDS通过疏水作用和蛋白质结合，

3、加入钾盐生成PDS沉淀可使蛋白质被共沉淀去除一些蛋白质可能仍与基因组DNA相互作用，将蛋白沉淀同时，可去除基因组DNA酚抽提可进一步去除蛋白质。乙醇可沉淀核酸，70%乙醇洗涤可去除盐分RNA酶可去除残留RNA经过上述步骤纯化即可得到质粒DNA实验步骤1.收集细菌：1.5ml细菌，离心10000rpm,2min2.吸取培养液将细胞沉淀尽可能干燥3.加100µL溶液I,充分悬浮原理葡萄糖：增加粘度，防止菌体沉淀Tris：缓冲作用，稳定pHEDTA：鳌合金属离子，抑制DNase，防止DNA降解4.加200µL溶液I

4、I（新鲜配制）,温和混匀（要少于5min）。SDS：是离子型表面活性剂，溶解细胞膜上的脂类，使之破裂使蛋白质变性NaOH（pH12.6）：破碎细胞膜，使核酸变性注意：此试剂现配现用，冬季应注意是否有结晶，否则加热使之融化，溶液变清澈5.加入150µL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。6.10000rpm离心5min，取上清，注意不要取到沉淀。原理：HAc：中和复性，使质粒DNA复性，但基因组DNA则容易在分子间部分复性形成网状结构K＋与SDS、蛋白质和膜形成溶解度小的沉淀7.酚抽提将上清中加入

5、酚：氯仿（1:1），反复振荡混匀10000rpm，离心5min取上清注意不要取到酚相；剩余的酚应盖好盖后丢弃，防止环境污染原理：酚使蛋白质变性，溶解度下降，通过离心去除。注意：酚为TE或Tris饱和酚。酚有腐蚀性，操作需带手套酚与氯仿：异戊醇上均覆盖了一层水相（为防止挥发和氧化），取液时应注意取下层的试剂。8.乙醇沉淀加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5-10min。10000rpm，离心5min。弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。原理乙醇可去除DNA的水化膜，使之沉淀。9.用1mL70％离心乙醇

6、洗涤质粒DNA沉淀，震荡并离心，弃上清，晾干。10.加入50µLTE缓冲液，其中含有20µg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。目的：去除盐分目的：去除剩余的小分子RNA注意事项加入溶液I后菌体需充分悬浮。加入溶液II后不可剧烈振荡，时间不可过长，否则可能会造成基因组DNA不能充分去除。加入溶液III后混匀需将沉淀重复分散，但也不可过分剧烈。酚有腐蚀性，操作时需带手套。酚抽提后吸取水相上清时要避免将酚相吸入，否则会造成蛋白质去除不完全、影响乙醇沉淀以及质粒中酚的残留。乙醇沉淀步骤需充分混匀。