实验一：质粒提取实验

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1、实验一质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳分子生物学实验一实验目的掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。二实验原理培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA共价闭环DNA（cccDNA）线状DNA（lcDNA）开环D

2、NA（ocDNA）三个基本步骤质粒存的形态碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，

3、分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个

4、限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位点分别为GAATTC和AAGCTTCTTAAGTTCGAADNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子

5、的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间接含质粒的单菌落于2mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取2.0mL菌液入2.0ml的

6、dorf管中5000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性三实验步骤4℃，10000rpm，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加700μL的氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min4℃，10000rpm，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管加1.

7、0mL无水乙醇（充分混匀），-20℃放置20min4℃，10000rpm，离心10min，弃上清加入500μL70%乙醇，将沉淀悬起4℃，5000r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作：实验组对照组(不做）Buffer40EcolⅠ30HindⅢ30质粒XXddH2O10-X20-X总体积2020充分混匀后于37℃保温2-3h。（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2μg/μL）三实验步骤

8、制胶——1.0％琼脂糖凝胶(50ml)凝胶板的制备——小心加入2－3μlEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）点样——样品20μl，与4μl溴酚兰混匀(DNAmaker3μl加入10μl水与4μl溴酚兰混匀)电泳——稳压80v，DNA向阳极移动,大约50-60min观察和拍照——254nm紫外灯下观察四实