实验3质粒的提取和鉴定ppt课件.ppt

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1、碱变性法小量提取质粒DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组目的掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体掌握质粒酶切鉴定原理,学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的

2、方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：1.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对

3、分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）3.溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光原理示意图限制性核酸内切酶:一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性切酶以内切的方式水解核酸

4、链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。限制性核酸内切酶分类识别切割特性催化条件是否具有修饰酶活性至2005年1月，共发现限制酶3681种Ⅰ型59种Ⅱ型3612种Ⅲ型10种商业化的限制酶有588种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。Ⅱ型限制与修饰系统占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’端突出，3’端突出和平末端。酶切反

5、应中应注意以下几个问题：1.内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端；2.内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1µgDNA用2-3U酶进行酶切为宜；3.内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力；4.操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。5.DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。反应缓冲液：1.反应缓冲液:

6、主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶的辅基；A.Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间；B.NaCl浓度：低盐(10mMNaCl)中盐(50mMNaCl)高盐(100mMNaCl)2.酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。3.酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。4.酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下，0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1

7、U)。三质粒提取实验材料与试剂（一）实验材料：过夜培养大肠杆菌DH-5a（二）实验试剂：LB培养基0.1MNaCL、10mMTris.CL（pH8.0）、1mMEDTA、Amp50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖TE：10mMTris.CL（pH8.0），1mMEDTA溶菌酶10mg/ml（用10mMTris.CL，pH8.0，新鲜配制）溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ