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1、质粒DNA提取、鉴定暨大医学院生化教研室质粒（plasmid）存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。与染色体ＤＮＡ相比，质粒结构简单，分子大小不等。小的不到1.0×106道尔顿，大的则超过200×106道尔顿。质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞一定的表型。质粒分类：严紧型（每个细胞1－5个质粒）质粒的复制与宿主染色体复制同步进行，因
2、而一个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。当宿主蛋白合成被抑制，染色体复制停止，质粒的复制也停止；松弛型（每个细胞10－200个质粒）质粒的复制受“松弛型控制”。当宿主蛋白质合成受抑制（如加入氯霉素），染色体复制停止时，质粒仍可大量复制。此时，一个宿主细胞中质粒数目可多至数千个拷贝。具备基因工程质粒载体的条件：①多克隆位点（multiplecloningsite,MCS),一段短的序列上有多种限制性内切酶切口，每种只有一个切口。②选择性标记，如抗药性。③本身分子量不宜过大，有一定容量。④有一定的抄本数（copynumb
3、er）——每个宿主菌可能容纳的最多质粒数。pBR322质粒(4.36kp),最早应用于基因工程的载体，现在仍在广泛应用。•序列已全部清楚•数十个内切酶位点•2个抗药基因pBR322质粒(4363bp):主要包括：①限制性内切酶位点（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。③含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。pBR322共有２４种限制性内切酶的单一的识别位点，其中７种酶（EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII,NruI）的识别位点位于四环素抗性基因内部，２种酶
4、（ClaI,HindIII）的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这９个限制性内切酶位点上插入外源ＤＮＡ通常都会导致四环素基因（tetr）的失活。３种酶（ScaI,PvuI,PstI）在氨卞青霉素抗性基因（ampr）内具单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。pUC18/19pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与Ｍ13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体。即是将组建Ｍ13ｍｐ系列载体所用的LacZ片段插入到pBR322的一种缺失变种之中。E.coli的LacZ的N端146个AA残
5、基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段pUC18/19含有来自pBR322质粒复制起始点（ori），氨卞青霉素抗性基因（ampr）以及大肠杆菌β半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码α肽链的ＤＮＡ序列，并且在LacＺ基因中有一段多克隆位点（ＭＣＳ）区段。另外与pBR322相比
6、，pUC质粒载体具有更小的相对分子量。而且无控制质粒复制的rop基因，使得其拷贝数大增。每个细胞可达500-700个拷贝。因此，由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆ＤＮＡ分子。pUC18/pUC19区别在多克隆位点以互为相反的方向排列，余相同。当外源的DNA片段插入到多克隆位点时，使α互补链破坏形成的是无活性的β半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌细胞，就在Xgal-IPTG培养基上形成白色菌落，而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。本次实验用pEC
7、-CTpEC-CT在pcDNA3基础上构建pEC-ct质粒：8.0kb有HindⅢ,BamHⅠ酶切点，可切出CD基因（1.2kb）质粒DNA提取和纯化步骤：培养细菌收集和裂解细菌纯化质粒DNA细菌的培养细菌培养从-20℃取出储存菌液，斜面划线接种于培养板。2.单克隆培养：挑取单个菌落，接种到培养瓶中，37℃培养24h。3.扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50μg/ml),振摇200rpm，37℃(4-6h),使A580＝0.4-0.6。4.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40μg/ml，继续培养
8、15-17h.本次实验用碱裂解法提取DNA包括：1.菌体收集2.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化3.鉴定2人一组原理：碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈
