弓形虫感染与HeLa细胞凋亡的初步研究

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1、分类号墅墨215UDC579编号!Q2窆窆墨!!!垒Q12@；工．薄大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目弓形虫感染与HeLa细胞凋亡的初步研究学科专业作者姓名指导教师答辩日期病原生物学沈进陈盛霞教授2014年6月分类号——UDC．．．．．．．．．．．．．．．．．．．硕士学位论文密级——编号——弓形虫感染与HeLa细胞凋亡的初步研究ThepreliminarystudyontheHeLacellapoptosiswithToxoplasmagondiiinfection作者姓名：沈进指导教师：陈盛霞教授申请学

2、位：硕士学科专业：病原生物学论文提交日期：2014年04月28日论文答辩日期：2014年06月10日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2014年06月答辩委员会主席：评阅人：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者箜

3、名：f艺迂日期：沙719年6月c少日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不

4、保密口。学位论文作者签名：I叱递yf丫年6月I善日指导教师签名：阴—穰^7pff年石月，扩日江苏大学硕士学位论文摘要目的：以刚地弓形虫RH株速殖子感染HeLa细胞，研究弓形虫感染调控宿主细胞凋亡的能力，探讨弓形虫致密颗粒抗原1(GRAl)的分泌与宿主细胞凋亡的关系。方法：24孔细胞培养板内接种HeLa细胞，培养16h后各孔接种不同数量(M01分别为O．1、1、5和10)弓形虫速殖子，4h后在培养液中加入终浓度为O．599／ml放线菌素D(ActD)诱导凋亡，于加药后8h、12h、24h和36h收集细胞，通过Hoechst33258染色

5、法和AnnexinV-FITC／PI法检测HeLa细胞凋亡率。根据ToxoDB基因库中GRAl基因序列，DNAstar软件设计并合成1对特异性引物。以弓形虫cDNA为模板，PCR扩增GRAl基因。构建重组质粒GRAl／pTGl9一T和GRAl／pET-32a，在大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达。Ni—NTA亲合层析柱纯化重组GRAl蛋白并制备其兔多克隆抗体，Westernblotting技术鉴定此多克隆抗体。24孔和6孔细胞培养板内分别接种HeLa细胞，培养16h后各孔按MOI=10比例接种弓形虫速殖子。感染后O～60

6、min(10min、20min、30min、40min、50min、60min)和1～36h(1h、4h、8h、12h、24h、36h)，以Hoechst33258染色和AnnexinV-FITC／PI法检测HeLa弓形虫感染与HeLa细胞凋亡的初步研究细胞凋亡率，采用Westernblowing技术检测GRAl表达。结果：弓形虫感染HeLa细胞8h时，各感染组细胞凋亡率与ActD诱导对照组无明显差异(P>O．05)。感染12h时，MOI=0．1组和MOI=I组HeLa细胞凋亡率明显低于ActD诱导对照组(尸

7、量增加，HeLa细胞凋亡率显著增高，MOI=5组和MOI=10组细胞凋亡率明显高于ActD诱导对照组(尸O．05)，而MOI=I组、MOI=5组和MOI=10组细胞凋亡率明显高于ActD诱导对照组(尸

8、果表明，24kDa处有一条明显的蛋白表达条带，与理论值大小一致。弓形虫感染HeLa细胞60min内，HeLa细胞凋亡率先降低(O～30min)再升高(30～60min)；感染后1～36h，随着时间的延长，HeLa细胞的凋