ala-pdt对hela和caski细胞增殖凋亡机制的初步探讨

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1、学校代码：10246‘；：09211250011硕士学位论文(专业学位）ALA-PDT对Hela和Caski细胞增殖凋亡机制的初步探讨院系：医学院专业：妇产科学姓名：林倩如指导_t师：隋龙主任医师完成日期：2012年3月10日目录中文摘要1英文摘要3ms6第一部分：ALA-PDT对Hela、Caski细胞增殖与凋亡的影响8材料与方法8结W：11^17第二部分：ALA-PDT对Hela、Caski细胞内Caspase-3、P53、HPVE6/E7mRNA表达的影响17材料与方法17结^19^22第

2、三部分：ALA-PDT对Hela、Caski细胞内P53、cleavedCaspase-3蛋白水平的调控22材料与方法22^^25结论25H26^论31参考文献32英文缩略词表35m^36Mi射44中文摘要宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有25万妇女死于宫颈癌，约50万宫颈癌新发病例，目前已明确HPV感染特别是高危型HPV持续感染与宫颈癌发病的密切关系。在所有HPV感染妇女人群中，最终约有10%发展为HPV持续感染状态。临床上仍缺乏有效的清除HPV感染的手段，目前没有针对HPV的治疗药

3、物，临床上常用的干扰素、HPV预防性疫苗疗效亦有限，针对大量HPV持续感染状态人群，亟待有效的防范或干预措施。光动力疗法（photodynamictherapy,PDT)具有创伤小、选择性强、重复性好、毒性小等优点，目前已广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，但在妇产科疾病特别是宫颈疾病方面仍处于起步阶段。本实验选用的光敏剂5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic，ALA)是第二代光敏剂，能选择性地积聚在病毒感染增殖活跃的细胞中，克服第一代光敏剂在体内滞留时间长、所需避光时间长、组织选择性差等缺

4、陷。本实验以宫颈鳞癌细胞Caski细胞和宫颈腺癌细胞Hela细胞为研究对象，通过SRB法、流式细胞仪、荧光实时定量PCR、蛋白免疫印迹法，探讨新型光敏剂5-氨基酮戊酸介导的光动力治疗(ALA-TOT)清除HPV感染的机制和诱导其凋亡的分子机理，为ALA-PDT最终走向临床提供实验依据和理论支持。目的1.观察ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞生长的影响，并筛选出ALA-PDT对宫颈癌细胞生长影响的最佳作用参数（光敏剂浓度+激光剂量）。2.观察ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Ca

5、ski细胞HPV18/16E6、E7基因mRNA的影响，明确其清除HPV感染的能力。3.测定ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞调亡相关基因表达的影卩M，探寻ALA-PDT诱导凋亡的通路。方法1.SRB法检测ALA-PDT作用于宫颈癌细胞Hela、Caski细胞后细胞生长的变化，并比较两种细胞对ALA-PDT的敏感性差异。2.AnnexinV/PI染色-流式细胞仪检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞凋亡的影响。3.Real-timePCR检测ALA-PDT对宫颈癌

6、细胞Hela,Caski细胞内Caspase-3、P53、HPV18/16E6/E7mRNA表达水平的影响。4.WesternBlot检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞内P53、cleavedCaspase-3蛋白的表达影响。结果1.SRB检测ALA-PDT对Hela和Caksi细胞增殖作用的影响：单纯的光敏剂ALA组或者单纯的光动力PDT组作用于细胞，与对照组相比，细胞的生存率差异无统计学意义（P〉0.05)。同一激光剂量、不同光敏剂浓度下，细胞的生存率有显著差异（P<0.

7、05)。对Hela细胞当光敏剂浓度在0.05-0.15mM之间，对Caski细胞当光敏剂浓度在0.05-0.20mM之间时，细胞的生长抑制率随着ALA浓度增加而显著提高（PC0.05)。同一光敏剂浓度、不同激光剂量，细胞的生存率均有显著差异（PC0.05)。随着光敏剂ALA浓度的增加、激光剂量的增大，ALA-PDT对细胞生存率影响逐渐增强，但当ALA浓度以及激光剂量增加到一定剂量时，对细胞的生存率影响达到饱和、不再增强。此外，Hela细胞对ALA-PDT作用比Caski细胞更敏感。2.Annex

8、inV/PI染色-流式细胞仪检测细胞凋亡：不同光敏剂浓度的ALA-PDT组的凋亡率与对照组相比有显著差异（P<0.05)。当光敏剂浓度剂量较低时，以早期凋亡为主；当光敏剂浓度加大到ImM时，以晚期凋亡为主，总凋亡率显著升高。3.Real-timePCR检测结果：与各自对照组相比，Hela细胞ALA-PDT组各目的基因的相对表达量，HPV18E6、HPV18E7表达均显著下调，而Caspase-3、P53表达均显著上调；Caski细胞ALA-PDT组各目的基因的相对表达量，HPV16E6、HPV1