timp-1对人卵巢癌a2780细胞生长的抑制作用

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1、TIMP-1对人卵巢癌A2780细胞生长的抑制作用第28卷第4期2006年8月大连医科大学JournalofDalianMedicalUniversityV0I.28No.4Aeg.2006TIMP一1对人卵巢癌A278o细胞生长的抑制作用单路娟,吴秦华,刘越坚,邱阳,郭莉,王玲(大连医科大学第一临床学院中心实验室,辽宁大连116011)摘要:[目的]观察基质金属蛋白酶组织抑制因子一l(TIMP—1)基因表达水平对人卵巢癌细胞生长的影响.[方法]采用质脂体法将正,反义TIMP—l表达载体体外转染到卵巢癌780

2、细胞中,用G418筛选稳定表达外源基因的克隆并用RT—PCR鉴定后扩大培养.以未转染组细胞作为对照,分别用直接计数法,四氮唑蓝(MTT)比色法,平皿克隆形成试验测定3组细胞的增殖活性,利用流式细胞术检测肿瘤细胞周期与凋亡的变化.[结果]与对照组相比,转染TIMP—l对卵巢癌细胞780呈现增殖抑制效应:生长曲线示增殖速度减慢(P<0.01);在平皿上的集落形成能力下降(38±3.05)%;MTT法结果显示增殖抑制率增加(P<0.01);细胞周期显示Go/Gl期比例增加(58.41±0.94)%.转染

3、反义TIMP—l对卵巢癌细胞A27s0呈现促增殖效应:生长曲线示增殖速度加快(P<,0.01);在平rrrt上的集落形成能力增强(59±2.08)%;MTT显示增殖抑制率减小(P<0.01);细胞周期显示Go/Gl期比例减小(44.82±0.31)%.[结论]体外转染TIMP—l基因提高TIMP—l的表达可抑制卵巢癌细胞的增殖,TIMP—l可能成为卵巢癌基因治疗的一个新靶点.关键词:TIMP—l;卵巢癌;基因转染中图分类号:R737.31文献标识码:A文章编号:1671—7295(2006)o4—

4、0273—03基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMP)之间的相互作用及平衡状态是恶性肿瘤发生,发展的分子生物学机制中一个至关重要的中间环节.自1981年组织特异性金属蛋白酶抑制因子一l(tissueinhibitorofmetallo.protelnasesl,TIMP—1)被发现以来,因其在维持胞外基质(ex.tracellularmatrix,ECM)的稳态中具有的

5、重要作用,一直是分子细胞生物学研究的重点.TIMP—l是一种相对分子质量为28.5kD的糖蛋白,它能与活化的间质胶原酶卜Ⅲ型,基质溶解素及相对分子质量为92kD的Ⅳ型胶原酶形成l:1的复合物,从而抑制MMP的活性.随着对其结构,功能研究的不断深入,目前发现TIMP—l除了抑制金属蛋白酶的活性外,还可对多种细胞行为,如细胞生长,存活,迁移等产生影响.是—个多功能分子¨J.据报道,某些肿瘤其恶性程度与MMP(特别是MMP一2,MMP一9)的过表达成正相关L2J.研究还发现,MMP与TIMPs相互作用的结果与肿瘤细

6、胞侵袭与转移有相关性.本文采用质脂体法将正,反义TIMP—l基因的表达载体稳定转染于A舳卵巢癌细胞系,对TIMP—l在卵巢癌A2780细胞系中的作用进行探讨,并发现TIMP—l对卵巢癌A27鲫细胞的生长产生抑制作用.1材料和方法基金项目:国家自然科学基金资助(30370620)收稿日期:2006—03—22;修回日期:2006—05—29.通讯作者:吴泰华(1965一),男,江西上饶人.教授,博士.1.1材料1.1.1实验试剂:RNA提取试剂(TRIzo1),逆转录试剂盒购自大连宝生物公司,MTT,胰酶购自S

7、igma公司;IMDM培养基,新生牛血清,脂质体Lipofectamine,G418等为GIBCO公司产品.1.1.2细胞及质粒:A2780卵巢癌细胞系为本实验室保存,人反义(PTas)和正义(PTs)TIMP—l表达载体由本实验室保存.1.1.3实验仪器:相差显微镜,紫外可见分光光度计.DNA和蛋白电泳装置,UVP凝胶成像分析系统,c02恒温培养箱.1.2方法1.2.1TIMP—l质粒的大量制备:①大肠杆菌转化;②挑取阳性克隆并扩大培养;③碱裂解法抽提质粒.1.2.2细胞培养和基因转染:①细胞培养A2780

8、卵巢癌细胞以含有lO%d~牛血清的IMDM完全培养基(含100u/mL青霉素和100me/mL链霉素)培养于37~C,5%co2的培养箱中,隔天换1次液.②基因转染脂质体包裹重组正反义质粒PTs,PTas转染对数生长期的约60%一80%融合的A27舳细胞,经48—72h,待细胞生长接近融合时按l:3密度传代.同时加浓度为800g/mLG418的IMDM培养液进行筛选.将转染了正义,反义TIMP质粒及