雌二醇对aβ-诱导小鼠海马神经元细胞影响

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1、雌二醇对Aβ1-42诱导小鼠海马神经元细胞影响[摘要]目的研究Aβ1-42诱导小鼠海马神经元凋亡机制。方法应用Aβ1-42处理小鼠海马神经元后，采用MTT法检测小鼠海马神经元细胞存活率，形态学观察海马神经元的特征，Westernblot法检测小鼠海马神经元caspase-3蛋白的表达。结果给予Aβ1-42处理的小鼠海马神经元的雌二醇保护作用后，小鼠海马神经元细胞数目减少，差异有统计学意义（P<0.05）。小鼠海马神经元染色质浓缩、核碎裂，小鼠海马神经元细胞凋亡率上升，小鼠海马神经元caspase-3表达增强，提示雌二醇可明

2、显改善小鼠海马神经元的各种变化。结论Aβ1-42通过caspase-3途径引起小鼠海马神经元凋亡，雌二醇可抑制Aβ1-42诱导的小鼠海马神经元凋亡来保护小鼠海马神经元避免发生凋亡。[关键词]雌二醇；神经元；凋亡；诱导[中图分类号]R255[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2012）06（a）-0029-049阿尔茨海默病（AD）是退行性中枢神经系统疾病，发病过程中细胞凋亡起主要的作用，大脑神经元对细胞凋亡的敏感性较高，尤其是大脑海马神经元对细胞凋亡极其敏感，神经元细胞凋亡是AD脑中细胞死亡的主要机制之一。雌激

3、素的作用极其广泛，除了对生殖系统的基本作用外，对大脑神经元也有保护作用，雌激素可以减少AD的发生率，与大脑的学习记忆、思考问题等密切相关。实验研究探讨Aβ1-42诱导小鼠海马神经元凋亡机制的实验研究，观察雌二醇对Aβ1-42诱导的小鼠海马神经元凋亡的保护作用，探索AD发病机制及其最佳的治疗方案。1材料与方法1.1材料雌二醇、Aβ1-42、胎牛血清、MTT、DMSO、Trypsin、培养基均购置Sigma公司，DydatechMR4000型酶标仪、CO2培养箱、caspase-3抗体购置SantaCruz等，荧光定量聚合酶链

4、反应为美国ABI公司产品，GIS凝胶成像系统为上海天能公司产品，FACsort流式细胞仪系美国BectonDickinson公司，AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒购自美国Oncogene公司。1.2小鼠海马神经元培养及其样品处理妊娠2周的昆明小鼠，消毒皮肤，取胎鼠脑，切双侧大脑海马剪碎后，移入消化液中，37℃温箱中消化20min，隔10min取出摇匀。弃上清，组织悬浮于完全培养基中，将上层细胞悬液经100目不锈钢网过滤，收集两次过滤的单细胞悬液进行计数，台盼蓝染色法计数细胞活力。调整活细胞密度为1×106/mL，接种6孔培

5、养板，培养箱中孵育1d。培养至7~109d的神经细胞经小鼠海马神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学鉴定处理。将Aβ1-42溶解培养基中，孵箱中孵育7d，-20℃贮存备用。将小鼠海马神经元细胞接种在6孔培养板，待细胞生长良好加入含不同浓度Aβ1-42DMEM培养液，100L/孔。培养细胞加入Aβ1-42浓度为40μmol/L，建立小鼠海马神经元实验模型。1.3分组及药物处理实验分为三组：对照组、模型组、雌二醇组。对照组细胞加入无菌的PBS缓冲液正常培养1d后进行检测；模型组小鼠海马神经元培养后，加入终浓度为40μmol/L的Aβ

6、1-42作用1d诱导小鼠海马神经元损伤；雌二醇组小鼠海马神经元培养，在加入Aβ1-42前，分别加入浓度为200、100、50μmol/L的雌二醇预处理4h，再加入终浓度为40μmol/L的Aβ1-42作用1d诱导小鼠海马神经元损伤。1.4小鼠海马神经元形态学光镜观察倒置显微镜观察体外Aβ1-42诱导小鼠海马神经元凋亡，取对数生长期小鼠海马神经元接种培养瓶，用胰蛋白酶消化小鼠海马神经元，制成5×104个/mL单小鼠海马神经元悬液接种于内铺小玻璃片的24孔培养板内，置于37℃，5%CO2培养箱内培养48h，洗涤2次，室温干燥，

7、光镜下观察拍照。1.5小鼠海马神经元形态学电镜观察9选取小鼠海马神经元接种培养瓶中，将培养小鼠海马神经元随机分成三组：对照组、模型组、雌二醇组。三组培养1d后以PBS洗涤，、取出小鼠海马神经元，移入离心管，1000r/min离心15min，弃上清，经过2.5%戊二醛预固定2h，继续用四氧化锇固定、脱水、包埋、切片、染色、观察。1.6MTT法检测小鼠海马神经元对药物的敏感性小鼠海马神经元细胞培养贴壁，加入药物均按1∶10逐级稀释的方式分6个浓度，每种药物的每一浓度设4个重复孔，加药后置培养箱中常规培养。另设空白组，培养2d后

8、弃上清，每孔加入1g/LMTT100μL，继续培养4h，吸净MTT液，再加入DMSO100μL，室温振荡混匀30min，充分溶解后在酶标仪570nm下测吸光度（A）值。1.7Western印迹法检测小鼠海马神经元caspase-3蛋白表达收集小鼠海马神经元，提取总蛋白，测定蛋白质含量。50μg细胞蛋白S