氧化应激诱导小鼠海马神经元microrna表达谱的改变及验证

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1、河北医科大学硕士学位论文氧化应激诱导小鼠海马神经元microRNA表达谱的改变及验证姓名：牛静亚申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：许顺江201203中文摘要氧化应激诱导小鼠海马神经元microRNA表达谱的改变及验证摘要目的：随着科技和经济的发展，现代社会人口老龄化趋势迅速增长，老年性痴呆(Alzheimer’SDisease，AD)的患病率逐年上升，严重影响老年人的生存质量。AD是最常见的一种神经退行性疾病，以进行性认知功能障碍为特征，主要病理改变为皮质神经元数量减少、神经纤维缠结(neurofibrillarytangle，NFT

2、)和含有p一淀粉样肽(p-amyloidpeptide，Ap)的老年斑(senileplaque，SP)的形成以及部分脑区(海马、新皮质和基底前脑等)神经突出消失等。AD的病因复杂，一般认为由基因突变、老化、外伤等多种因素引起，目前尚无有效的治疗方法，给个人、家庭和社会带来沉重的负担。关于AD的发病机制存在多种学说，包括氧化应激学说、基因突变学说、Ap级联学说、Tau蛋白假说、线粒体功能障碍和自噬等，其中氧化应激学说备受关注。大量研究证实氧化应激最早参与了AD的病理进程。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，

3、通过抑制mRNA的转录后翻译调控蛋白的表达。大量研究表明，miRNAs在脑老化及神经退行性疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。但在氧化应激致AD发病早期，miRNAs表达的改变及其对靶分子的调控机制尚不清楚。H202是一种稳定的活性氧自由基。本研究以H202刺激原代培养的海马神经元制备氧化应激细胞模型，检测氧化应激诱导的miRNAs表达谱的改变。对差异性表达miRNAs进行Real．timePCR验证，并对其靶基因进行生物信息学分析，筛选可能与氧化应激致AD发生有关的miRNAs。为进一步研究miRNAs在AD发病中的作用和调控机制以及开发以miRNA

4、s为靶点的相关药物提供依据。方法：(1)实验动物：封闭群清洁级健康快速老化模型小白鼠(SenescenceAcceleratedMouse，SAM)。(2)实验方法：①海马神经元分离培养：选择孕18．19天的SAMRl小鼠，取出完整的胎鼠海马组织进行分离培养，以5×108cells／L接种至直径35mill的培养皿中(2ml／dish)，用于提取RNA进行基因芯片筛选及Real．timePCR验证；以5×107cells／L中文摘要接种于96孔板中(200叫孔)，用于测定细胞活力；以1X108cells／L接种于24孔板中(1ml／孔)，用于测定细胞凋

5、亡、坏死。②海马神经元的鉴定：对生长到第7天的海马神经元进行特异性标志物微管相关蛋白2(Microtubule．associatedprotein2。MAP．2)免疫荧光染色，鉴定海马神经元。⑨MTT法测定细胞活力：将生长7天的海马神经元随机分为5组，每组中分别加入0、100州、200州、400州、800州的H202处理24h，用MTT法测定细胞活力，观察细胞损伤情况，选择合适的H202刺激浓度。④采用TUNEL和PI染色测定细胞凋亡、坏死：将生长了7天的海马神经细胞随机分为2组，其中一组加入正常neurobasel培养液，另一组加入含200州H202

6、的neurobasel培养液，24h后用TUNEL和PI染色法测定细胞凋亡、坏死。⑤提取细胞总RNA进行miRNAs基因芯片筛查：应用Qiagen公司的MiRNeasyMiniKit试剂盒提取正常培养和200州H202刺激6h后的海马神经元总RNA，NandropND．1000分光光度计测定RNA质量，1％琼脂糖凝胶电泳测定RNA纯度，采用AffymetfixmiRNA基因表达谱芯片GeneChipmiRNA2．0Array进行杂交，检测海马神经元miRNAs的表达谱。(查)miRNAs生物信息学分析：根据基因芯片结果，筛选出倍数变化在1．5倍以上的m

7、iRNAs，应用DAVID软件对miRNAs的靶基因进行生物信息学分析。⑦筛选与AD发病有关的miRNAs采用Real-timePCR方法进行验证。⑧统计学方法：所有数据采用i±s表示。用SPSS13．0软件进行数据处理，采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析，以尸

8、活力测定：MTT结果显示，不同浓度的H202刺激海马神经元，细胞活力明显降低(P<0．01)，