鳄胆素与阿霉素联合应用对肝癌smmc-7721细胞凋亡的影响

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1、鳄胆素与阿霉素联合应用对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响丁玉梅，翁梦婷，毛云子，董欣，邓轶韬，陈清西收稿日期：2015-04-23基金项目：厦门市科技计划项目（3502Z20133009）；国家自然科学基金委基础科学人才培养基金科研训练及科研能力提高项目(厦门大学)（J1310027）；厦门大学生物学科拔尖计划项目*通信作者：chenqx@xmu.edu.cn（厦门大学生命科学学院，福建厦门361102）摘要：研究了鳄胆素（crocodilecholine，Cro）联合阿霉素（doxorubicin,Dox）对人肝癌

2、细胞SMMC-7721凋亡的诱导作用．用鳄胆素（15μg/mL）和阿霉素（0.4μg/mL）单独或联合作用SMMC-7721细胞后，测定了培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的渗漏率，AO/EB荧光染色观察细胞的凋亡形态，流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平和细胞线粒体膜电位变化，Westernblot检测凋亡相关蛋白CytC及p53的表达量的变化．结果显示鳄胆素和阿霉素单独或者联合使用都能促进细胞中LDH的渗漏，与对照组相比，联合作用组有极显著差异（p＜0.01），其作用呈时间依赖性．经药物处理后，AO/EB荧光染色发现细

3、胞核出现明显的凋亡特征．细胞中ROS水平显著升高，同时细胞线粒体膜电位降低．Westernblot结果显示单药组及联合用药组都能上调促凋亡蛋白p53的表达，促进凋亡蛋白CytC由线粒体释放到胞质中，联合用药组作用效果更为显著．以上结果表明鳄胆素和阿霉素单独或联合都对人肝癌SMMC-7721细胞有凋亡诱导作用，且以联合用药组作用效果更加显著．两药联合作用可能是通过线粒体介导的内源性途径诱导细胞发生凋亡．本研究有望为肝癌的联合用药治疗提供理论依据．关键词：鳄胆素；阿霉素；联合用药；肝癌；细胞凋亡；线粒体途径中图分类号：Q35

4、6．1文献标志码：A肝癌是人类常见恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤发病中男性居第五位，女性居第七位；致死率居恶性肿瘤第三位，仅次于肺癌和胃癌[1]．我国是乙肝大国，约有1.7亿人是乙肝病毒携带者；乙肝是肝癌的主要诱因之一，我国肝癌患者85%~90%源自乙肝，且每年新增肝癌患者数约占全球的50%[2]．手术切除仍是提高肝癌生存率的主要方法，但多数患者会出现术后复发、转移等，需要使用全身化疗法辅助治疗[3,4]．化疗是一种全身性治疗方法，对原发灶、转移灶均有治疗作用．阿14霉素是临床肝癌的常用化疗药物，单药有效率能达到16%[5]。

5、但同多数化疗药物一样选择性差，对正常细胞有杀伤作用，毒副作用很强，容易产生耐受性，在临床的应用受到了一定的限制．因此，寻求新的更有效的肝癌治疗方法和抗肝癌药物组方是现在医药界面临的重要挑战．本实验室前期研究发现鳄胆素、阿霉素单独作用对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显的抑制作用，两者联合使用有协同效果．鳄胆素与阿霉素联合使用不仅能抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖及细胞的集落形成能力，还能使细胞周期发生S期阻滞，诱导细胞凋亡．本研究拟以肝癌SMMC-7721细胞为研究对象，用筛选得到具有协同作用的鳄胆素和阿霉素联合

6、组方作用于SMMC-7721细胞，探讨两者联合对肝癌细胞凋亡的诱导作用．本研究有望为鳄胆素联合阿霉素的临床使用提供理论依据．1．材料与方法1.1材料鳄胆素由本实验室从暹罗鳄胆汁中经皂化、酸化、萃取等步骤提取分离得到的白色粉末，是多种胆汁酸的混合物；-20℃避光保存．临用前二甲亚砜（DMSO）溶解，0.22µm微孔滤膜过滤除菌．阿霉素购自上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；DCFH-DA和Rh123购自Sigma公司；AO和EB购自Amresco公司；人肝癌

7、SMMC-7721细胞由厦门华侨亚热带植物引种园惠赠．1.2实验方法1.2.1细胞培养及分组肝癌SMMC-7721细胞在含10%胎牛血清、1%（质量分数）双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基（pH7.2），37℃、5%（体积分数）CO2中培养．课题组前期研究已筛选出鳄胆素与阿霉素联合使用具有协同作用的联合组方为鳄胆素（15μg/mL）+阿霉素（0.4μg/mL），因此本实验分为对照组，鳄胆素单用药组（15μg/mL）、阿霉素单用药组（0.4μg/mL）和联合用药组(15μg/mL鳄胆素和0.4μg/mL阿霉素

8、）．141.2.2普通光镜下观察细胞形态取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞接种于6孔板中培养过夜，加药处理48h后，倒置显微镜下观察细胞形态．1.2.3乳酸脱氢酶（LDH）活力测定药物分别处理SMMC-7721细胞24和48h后，取培养液上清按照LDH试剂盒说明书（南京建成生物技术有限公司）进行操作并在450n