pcr体系优化

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1、由于TaqDNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。A镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够，那么TaqDNA聚合酶则无法行使功能(figure1)。过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增。因此，研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1~4mM，每次增加或降低0.5~1mM。扩增

2、产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如，PfuDNA聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低，但其优化范围通常为2~6mM。许多DNA聚合酶产品提供Mg-freereactionbuffer和单独一管25mMMgCl2，这样就可以自行调节Mg2+浓度，优化反应体系。MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为获得均一的溶液，在配液的时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步，溶解和混匀，常常会造成实验失败。有些科学家倾向于使用包含MgCl2的buffer，MgCl2的终浓度为1.5mM。值得注意的是有

3、文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM的变化，如果在90℃加热10min，则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。Figure1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。用不同浓度Mg2+测试，产物大小为1.8kb琼脂糖凝胶电泳，EB染色泳道M为MAKER;Lane1,0mMMg2+;Lane2,0.5mMMg2+;Lane3,1mMMg2+;Lane4,1.5mMMg2+;Lane5,2mMMg2+;Lane6,2.5mMMg2+;Lane7,3mMMg2+andLane8,3.5mMMg

4、2+BBuffer缓冲液大多数Buffer里含有一种缓冲试剂，多数为基于Tris的缓试剂。此外还有盐类，通常为KCL。缓冲试剂调节反应体系的pH值，pH值会影响DNA聚合酶的活性和保真度。与不添加KCL的比，适量的KCL能够增加50~60%DNA聚合酶的活性。一般来说，KCL浓度为50mM。C酶浓度我们推荐（promega的科研人员）在50微升体系中使用1-1.25unitsTaqDNA聚合酶。多数情况下，这些酶是过量的，再添加酶并不能显著提高产物量。事实上，酶量不断升高会增加TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性，跑胶的时候会观察到弥散的条带。想要准确吸取少量的含

5、50%甘油的酶溶液是非常困难的，因此建议一次配置大量的预混液，这样酶的加量便会很大，减少误差。DPCR引物设计引物决定扩增区域和扩增子的大小，引物长度一般在15~30bp。理想状态下的引物其GC含量应该在40~60%，避免在引物3’端出现三个连续的G或C以减少非特异性结合。还要避免自身或者引物间互补，以降低引物二聚体。引物自身二级机构干扰退火时引物与模板的结合。正反向两条引物之间Tm值相差不超过5℃，以便两条引物在同一退火温度下拥有相似的扩增效率。可以在引物上添加其他用途的序列，比如在5’端添加酶切位点序列，方便下一步的克隆，或者添加T7RNA聚合酶启动子，以便进行

6、体外转录。实际应用中会发现不同软件给出的Tm值不同，同一软件不同参数得出的Tm值也不同。不必纠结于此，只需要使用同一个软件统一参数去评估一个项目中所用的引物就好，Tm值只是一个相对的标准，不论哪种软件只要你的所有引物都在一个标准体系内评定，不会影响后续实验的分析。就好比你带两块表反而不知道具体时间，只需要有一个标准参考体系即可。E模板质量扩增依赖DNA模板的数量和质量。核酸纯化过程中经常使用的试剂（盐类、胍、蛋白酶、有机溶液和SDS）是潜在的DNA聚合酶抑制剂。例如0.01%SDS会导致90%TaqDNA聚合酶活性被抑制，而0.1%SDS则会抑制99.9%的TaqDNA聚合

7、酶活性。其他PCR抑制剂有苯酚、肝素、二甲苯蓝、溴酚蓝、植物多糖和多胺类物质精胺和亚精胺。有些情况下，抑制剂并不是随着核酸模板进入反应体系内的，例如紫外照射下的聚苯乙烯和聚丙烯会释放抑制物，如果使用此类物质作为反应管，有可能干扰PCR。如果你觉得扩增失败是由于模板溶液中存在抑制剂，那么向反应液中再加入以前扩的很好的对照DNA模板和引物对，如果扩增效果变差，那可能就有干扰物质，清理DNA模板，重点检查苯酚、氯仿和乙醇等。F模板量扩增所需的模板量依赖于DNA样本的复杂性。例如，4kb的质粒含1kb的目的序列，