正交设计优化硬叶兜兰ssr―pcr反应体系

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1、为了确保“教学点数字教育资源全覆盖”项目设备正常使用，我校做到安装、教师培训同步进行。设备安装到位后，中心校组织各学点管理人员统一到县教师进修学校进行培训，熟悉系统的使用和维护。正交设计优化硬叶兜兰SSR―PCR反应体系　　摘要：以构建珍稀物种硬叶兜兰SSR-PCR反应体系，采取正交设计试验对硬叶兜兰SSR体系组分中的Mg2+、基因组DNA、DNATaq聚合酶、dNTPs、引物5个因素在4个不同程度上进行了组合试验，之后对反应体系中该引物的退火温度在梯度PCR仪上筛选，并进行了最优体系的验证。试验结果显示

2、：体积为10μL的PCR管中最优组合为：模板DNA20ng，Mg2+mmol/L，dNTPsmmol/L，引物μmol/L，Taq酶U，10×buffer1μL，引物PR710的退火温度为℃，说明该体系具有较好的实用性。　　关键词：硬叶兜兰；正交设计；SSR　　中图分类号：S682　　文献标识码：A文章编号：09505　　1引言　　硬叶兜兰是兰科中珍稀物种，主要分布于我国西南部，其观花时间长，花色朴素淡雅，花型独特，具有非常高的观赏价值[1，2]，在多国举行的兰花展场上曾经获得总冠军。近年来人们对硬叶兜兰

3、野生种过度的挖掘使得个体和居群数量快速下降，因此对其研究和保护迫在眉睫。为了充分发挥“教学点数字教育资源全覆盖”项目设备的作用，我们不仅把资源运用于课堂教学，还利用系统的特色栏目开展课外活动，对学生进行安全教育、健康教育、反邪教教育等丰富学生的课余文化生活。为了确保“教学点数字教育资源全覆盖”项目设备正常使用，我校做到安装、教师培训同步进行。设备安装到位后，中心校组织各学点管理人员统一到县教师进修学校进行培训，熟悉系统的使用和维护。　　目前硬叶兜兰的研究主要是关于繁殖生物学和保护生物学。国内利用无菌播种研

4、究方法说明硬叶兜兰萌发率在50%左右，由于兜兰属植物种子没有胚乳，在种子培养时，适量的有机添加剂对其的萌发能提供较大的帮助[3]；在对其菌根研究发现，不同硬叶兜兰内生真菌生长速率差别很大，利用单菌丝团分离法效果显著，能解决分离过程污染问题[4，5]。　　在保护遗传学研究方面，一些学者对硬叶兜兰野生群体研究结果说明，不同居群有相当高的遗传差异，而且野生群内部存在一定的空间结构，所以要考虑不同群体的遗传状况才能计划硬叶兜兰的就地保护[6，7]；有研究通过两种分子标记ISSR和SRAP对野生居群研究显示，硬叶兜

5、兰在物种水平上有较高的遗传分化[8]；在栽培引种领域，曾宋君等[9]通过对硬叶兜兰进行温室栽培，从西南等地引种100株，成活了85株，但是植株形体较差，嫩叶发育不良，在两年内仅仅6株在培养基质里开花；有学者从硬叶兜兰在南部地区应用前景分析表明，在该地区栽培时不能正常发育，而且开花率极低，再者其花朵开放时间短，说明在此地种植是不合适的，当地引种的植株生长状况也证实此问题[10]；就目前硬叶兜兰生境调查情况显示，它主要生长在石灰岩和灌木丛中，伴生物种丰富，呈聚集性分布[11～13]。为了充分发挥“教学点数字教

6、育资源全覆盖”项目设备的作用，我们不仅把资源运用于课堂教学，还利用系统的特色栏目开展课外活动，对学生进行安全教育、健康教育、反邪教教育等丰富学生的课余文化生活。为了确保“教学点数字教育资源全覆盖”项目设备正常使用，我校做到安装、教师培训同步进行。设备安装到位后，中心校组织各学点管理人员统一到县教师进修学校进行培训，熟悉系统的使用和维护。　　对野生硬叶兜兰居群进行保护需要对居群遗传多样性和亲缘关系进行分析。然而现代分子标记技术具有不受环境、生育阶段、不同组织等影响，和其他标记相比具有不可替代的作用[14]。

7、SSR又名微卫星，在亲缘关系、遗传遗传变异等方面有广泛的应用[15～17]。它具有位点多、多态性丰富、共显性、种属特异性，且重复性和稳定性好等特点，被认为是目前研究遗传最好的标记之一[18，19]。但是在兜兰属应用中几乎没有，在进行SSR分子标记时，反应体系中各种因素的浓度大小对试验效果具有重要作用。所以，一个最佳效果PCR体系的建立对SSR扩增结果准确性和重复性非常重要[20]。　　鉴于此，本研究已硬叶兜兰基因组DNA为模板，利用正交表L16对组合中的5个成分在4个程度上试验对照分析，并讨论每个因素浓度

8、的变化对结果的影响，最终�_定各个因素的浓度，并对选择出的体系进行验证。为硬叶兜兰在在分子领域的研究奠基一定的实验基础。　　2材料与方法　　材料　　实验材料　　选用云南东南部区域7野生硬叶兜兰居群叶片为实验材料。　　设备和仪器　　高速冷冻离心机，PCR扩增仪；电泳仪；凝胶自动成像系统；恒温水浴锅。　　试剂为了充分发挥“教学点数字教育资源全覆盖”项目设备的作用，我们不仅把资源运用于课堂教学，还利用系统的特色栏目开展课外活动，对学