促性腺激素释放激素在斑节对虾中的免疫定位及功能

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1、学校代码：10264研究生学号：M120150352上海海洋大学硕士学位论文促性腺激素释放激素在斑节对虾中的题目：免疫定位及功能Theimmunolocalizationandfunctionof英文题目：Gonadotropin-releasinghormoninpenaeusmonodon专业：渔业研究领域：水产生物技术姓名：韩萍指导教师：江世贵研究员上海海洋大学，上海，201306中国水产科学研究院南海水产研究所，广州，510300二O一五年四月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导

2、下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适

3、用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员委员委员秘书答辩地点南海水产研究所答辩日期上海海洋大学硕士学位论文促性腺激素释放激素在斑节对虾中的免疫定位及功能摘要斑节对虾（Penaeusmonodon）是我国重要的传统养殖虾类，但由于对其性腺发育调控机制的了解不清晰，育种过程中缺乏人工可控的性腺催熟技术，育种技术理论的升级受到制约。因此，了解性腺发育过程中的调节机制，探索发育相关激素的分泌规律及作用机制有重要意义。促性腺激素释放激素(gonad

4、otropinreleasinghormone,GnRH)是一种十到十二肽的神经激素，在动物的繁育中发挥重要作用。为了获知GnRH的在斑节对虾神经系统中的分泌规律、功能和作用机制，本研究利用组织切片，免疫组化，体外组织培养，反向液相色谱等方法研究了GnRH在斑节对虾神经系统中的分布及变化，确定了GnRH对卵巢发育成熟的诱导作用，并初步建立了斑节对虾GnRH分离纯化的方法。具体研究结果如下：（1）斑节对虾神经系统和卵巢组织结构通过石蜡切片，HE染色的技术研究了斑节对虾神经系统及卵巢的形态学及组织学结构。结果表明斑节对虾神经系统是由脑，围食道神经，胸神经及腹神经节

5、高度愈合而成，脑位于眼柄基部，由前脑，中脑，后脑和相连的神经束组成，脑中神经分泌细胞根据直径分为三类，分别为小型，中型及大型神经分泌细胞，根据在脑中的分布位置分为6-17神经分泌细胞群。在食道下神经，胸腹神各神经节也是由神经纤维及神经分泌细胞组成。斑节对虾卵巢分为六个期，其中成熟期（V期）卵子呈皮质杆状体。卵巢具有自发荧光现象，主要集中于滤泡细胞以及富含卵黄颗粒的次级卵母细胞、成熟卵母细胞的细胞质区域,荧光强度与卵巢发育阶段具有显著正相关性（P<0.01）。可根据荧光强度初步判断卵巢发育分期。（2）GnRH在斑节对虾生殖发育期神经系统及卵巢中免疫定位利用免疫组

6、化及定量PCR的方法研究了GnRH在斑节对虾卵巢发育五个时期（II至VI期）中在神经系统及卵巢中的免疫定位，以及在卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原的表达规律。结果显示阳性信号主要分布于脑、胸神经节的一些中型神经分泌细胞群，并且GnRH免疫阳性在各神经节的神经纤维中普遍分布，同时在次级卵母细胞也检测到免疫阳性。其次，GnRH-I类似物在斑节对虾III期脑组织中显示较强的免疫阳性，显著聚集在中型神经分泌细胞细胞质中，呈现高表达水平；然而在卵巢中GnRH-I类似物仅在成熟期V期次级卵母细胞与初级卵母细胞的细I上海海洋大学硕士学位论文胞间隙中发现免疫阳性。定量PCR结果显示在

7、发育不同时期中，肝胰腺卵黄蛋白原mRNA表达趋势与卵巢中不同，提示斑节对虾神经系统分泌GnRH-I型类似物，诱导卵巢成熟，在此过程中，肝胰腺卵黄蛋白原向卵巢转移。（3）GnRH体外培养对斑节对虾卵巢发育的影响采用离体卵巢组织培养的方法研究了中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）促性腺激素释放激素（EsGnRH-I）、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)促性腺激素释放激素（PcGnRH），多巴胺拮抗物地欧酮（DOM）及神经组织对斑节对虾卵巢发育的调-1-1-1控作用效果。结果表明：50ng•mlEsGnRH-I，500ng•mlPcGnR

8、H，0.3μg•mlDOM对离体卵巢的