klotho对缺血再灌注急性肾损伤中细胞自噬的作用及其机制研究

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1、Klotho对缺血再灌注急性肾损伤中细胞自噬的作用及其机制研究EffectofKlothoonAutophagyInducedInRenalIschemia/ReperfusionInjuryandItsMechanism研究生姓名关雪晶指导教师严玉澄教授学科（专业）内科学（肾脏病）答辩日期2015年4月Klotho对缺血再灌注急性肾损伤中细胞自噬的作用及其机制研究EffectofKlothoonAutophagyInducedInRenalIschemia/ReperfusionInjuryandIt

2、sMechanism学科专业内科学（肾脏病）研究生姓名关雪晶指导教师严玉澄教授指导小组顾乐怡、张敏芳、庞慧华、林星辉申请学位博士学位学号0127219142答辩日期2015年4月研究方向急性肾损伤的防治与研究关键词急性肾损伤，自噬，Klotho，细胞凋亡，缺血再灌注，机制资助基金国家自然科学基金（81170687，81470918）上海市科委医学引导项目（134119a2300）培养单位上海交通大学医学院附属仁济医院上海交通大学博士学位论文上海交通大学博士学位论文上海交通大学博士学位论文Klotho对缺

3、血再灌注急性肾损伤中细胞自噬的作用及其机制研究摘要第一部分缺血再灌注急性肾损伤中自噬的动态改变及与肾损伤的关系目的：体内外观察自噬与凋亡在缺血再灌注急性肾损伤（acutekidneyinjury，AKI）中的动态改变，探讨AKI过程中自噬与凋亡的关系。方法：80只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组（Sham，n=40）和肾脏缺血再灌注组（ischemia/reperfusion组,I/R，n=40），采用双侧肾蒂夹闭法建立缺血再灌注模型，于再灌注后0h、2h、5h、12h、1d、2d、3d和7d收集小

4、鼠的血液及肾组织；体外培养肾小管细胞（TCMK-1）随机分为常氧组（Normoxic，Nor组）、低氧组（Hypoxia，H6h，H12h，H24h组）和低氧/复氧组（Hypoxia/Reoxygenation，H/R2h，H/R4h，H/R8h，H/R24h组），检测小鼠肾功能；HE染色观察肾组织损伤情况；Annexin-V/PI染色检测细胞凋亡率；CCK-8方法检测细胞活性；Westernblotting检测肾组织和细胞自噬相关蛋白LC3、p62及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达情况，电镜观察肾

5、组织和细胞的自噬体结构。结果：1、体内实验：与Sham组相比，I/R2h肾组织自噬表达开始升高（p<0.05），表现为LC3-II/LC3-I的比值增高及p62蛋白表达的下降；第2d自噬水平最高（p<0.001），至第3d自噬开始下降但仍高于Sham组（p<0.05），第7d自噬降至正常水平，电镜下缺血再灌注第1d肾组织内出现吞噬了损伤线粒体和胞浆成分的自噬体结构；相比而言I/R后肾组织凋亡出现较晚，在I/R12h时肾组织Bcl-2/Bax比值开始下降，明显低于Sham组（p<0.01），第1d时凋亡最

6、明显（p<0.001），随再灌注时间的延长肾组织凋亡逐渐减轻，至第3dBcl-2/Bax比值上海交通大学博士学位论文已恢复至正常；血Scr和BUN分别在再灌注2h和5h开始上升，至第1d达峰值(Scr:130.00±30.07umol/Lvs14.00±6.60umol/L，BUN:45.57±8.67mmol/Lvs8.18±2.17mmol/L；p值均<0.001)，随后开始降低，分别在术后第7d和第2d恢复正常；HE染色显示再灌注第1d近端小管上皮细胞出现了相应的组织学损伤表现，至第7d肾组织损伤

7、明显减轻；2、体外实验肾小管细胞低氧刺激12h后肾小管细胞自噬开始上调（p<0.05），延长低氧至24h自噬进一步升高（p<0.001），细胞复氧4h、8h自噬水平开始下降但仍高于常氧组（p<0.05），电镜下复氧4h肾小管细胞内大量自噬体吞噬胞浆成分，复氧24h自噬降至正常水平；而细胞低氧刺激24h凋亡才开始出现，且复氧4h、8h后Bcl-2/Bax比值较单纯低氧24h组下降更明显（p<0.05），至复氧24h仍未恢复正常（p<0.001）；流式细胞术和CCK-8检测也发现低氧刺激24h后细胞凋亡开始

8、增多，细胞活性开始下降（p<0.05），复氧4h、8h凋亡细胞进一步增加，细胞活性也进一步下降，直至复氧24h细胞凋亡、活性仍未恢复正常。结论：缺血再灌注AKI损伤早期，自噬升高早于凋亡，而在AKI恢复期，自噬的下降晚于凋亡，自噬可能作为一种损伤适应性反应在AKI早期延缓凋亡的发生，在AKI恢复期促进肾组织的修复。第二部分调节自噬表达在缺血再灌注急性肾损伤中的作用及作用机制目的：观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，