中药单体小檗碱克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼的耐药性及其机制研究

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：中药单体小檗碱克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼的耐药性及其机制研究ThetraditionalchinesemedicineofberberineovercomesImatinib-resistanceinchronicmyelogenousleukemia作者姓名：丰茂晓指导教师姓名及学位、职称：费嘉博士、教授学科、专业名称：生物化学与分子生物学学位类型：学术学位论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期：独创性声明本人声明所呈交的

2、学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的

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4、，形成费城染色体（Ph）。费城染色体编码融合蛋白BCR-ABL，可以调节细胞体内多条信号通路，特别是激活酪氨酸激酶信号通路可以增加白血病细胞的恶性行为。伊马替尼(Imatinib.ST1571)可以竞争性的结合ABL上的ATP结合位点，是第一个用于CML治疗的酪氨酸激酶抑制剂，对于CML的治疗具有革命性的意义。然而，随着疾病的发展，一些患者中出现了对伊马替尼耐药的现象。研究发现伊马替尼治疗的耐药性主要是因为BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶位点区域发生了突变，进而使Imatinib不能与之结合。而非B

5、CR-ABL改变的耐药约占20%。在这些BCR-ABL蛋白激酶区域突变中，T315I突变引起耐药占到了15%~20%。小檗碱（berberine）为黄连、黄柏等多种植物中所含的一种生物碱，具有抗菌消炎，止泻，诱导凋亡和抗癌的效果。近年也发现其具有抗白血病活性。基于本课题前期研究，发现小檗碱具有克服CML的耐药性的作业，但确切的机制还不清楚。本课题首先探究小檗碱对CML细胞的抑制效应，用不同浓度的小檗碱处理对Imatinib敏感的人类CML细胞（K562、BaF3-P210）和耐药性细胞株（BaF3-P

6、210-T315I和SFO2细胞），并与Imatinib对照。实验结果显示，小檗碱在5μM浓度处理24h时，不仅可以抑制敏感K562和BaF3-P210细胞活力，也显著抑制耐药的BaF3-P210-T315I和SFO2细胞细胞活力。伊马替尼和小檗碱联合作用于敏感K562、BaF3-P210和耐药的BaF3-P210-T315I，实验显示，小檗碱可以增加K562、BaF3-P210对伊马替尼敏感性和克服BaF3-P210-T315I细胞对伊马替尼的耐药性性。同时还检测了小檗碱对耐药细胞细胞集落能力（co

7、lony）的影响，结果显示，小檗碱可以有效抑制耐药株BaF3-P210-T315I细胞的集落形成，而Imatinib不能显著抑制BaF3-P210-T315I细胞的集落形成；小檗碱也可以有效抑制BaF3-P210细胞的集落形成。进一步研究发现，小檗碱显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210I暨南大学硕士学位论文细胞系中的BCR-ABL蛋白水平，而对BCR-ABL的mRNA水平无显著改变，因而可以认为小檗碱降解BCR-ABL融合蛋白。最后，为了探索小檗碱降解BCR-ABL蛋白的机制，我

8、们检测了小檗碱处理细胞中的自噬现象和泛素化水平。结果显示，小檗碱处理后细胞中没有发生自噬现象，而在小檗碱处理BaF3-P210细胞，发现小檗碱可以增加细胞的泛素化水平。进而采用针对BCR-ABL免疫沉淀（IP），使用泛素抗体Westernblot检测发现BCR-ABL蛋白发生了泛素化。采用Studio4.1软件对小檗碱与BCR-ABL蛋白进行分子对接模拟，结果显示BCR-ABL共有3部位（SH2区域、蛋白激酶区域和F-肌动蛋白连接区域）可以与小檗碱蛋白分