沙眼衣原体ahpc基因克隆表达及过氧化物酶活性分析

《沙眼衣原体ahpc基因克隆表达及过氧化物酶活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号Ｒ３７５密级公开ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５＠或＃义書：Ｉ專鄭如同等学力硕±学位论文（学术学位）沙眼衣原体Ａｈｐｃ基因克隆表达及过氣化物蘇活性分析研究生姓名：杨晓春指导教师、职称：李忠玉教授学科专业：基础医学（病原生物学）＇■研究方向：病原体的致病机制、快速诊断与防治研究’一所在学院：医学院■’所在单位：邵阳医学高等专科学校附属隆院二〇—五年千二月巧＂、＇－－．—－Ｉ．一六一．八一今

2、Ｓ．…－Ｊ二Ｖ．＇，；只攀，■＊，＇某产一济．：？－．＇：，＜■．？．．．－？．締義孝义拿ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡ沙眼衣原休Ａｈｐｃ基因的克隆表达及过氣化物酶活性分析？论文作者签名？减鴻指导教师签名论文评阅人１；凌虹，教授，博导，哈尔滨医科大学基础医学院评阅人２：曾巧仁，教巧，情导，中南大学某础睽挙院答辩委员会主席：胡四海，教巧，硕导，南化大挙房学院１委员；曾铁兵，教巧，硕导，南化大学

3、戾挙院２委员；卿义衡，丰化檢於师，衞阳巿中也睽院委员３；刘彦，副教榜，硕导，南坐大学民挙院委员４，：蹲絲坐教按，硕导，南化大举戾挙院答辩日期：２０：Ｌ５年１２月１２日沙眼衣原体Ahpc基因克隆表达及过氧化物酶活性分析摘要目的：研究沙眼衣原体（C.trachomatis，Ct）感染是否引起巨噬细胞氧化损伤，分析Ct0866（烷基氢过氧化物还原酶，Ahpc）基因在感染过程中的表达及其在Ct抗氧化胁迫中起作用，为了解Ct的抗氧化机制提供实验基础。方法：将Ct感染巨噬细胞，并

4、在0h、3h、6h、9h和12h收集细胞，荧光法检测细胞内ROS的水平，Realtime-PCR检测Ahpc基因在感染不同时间的变化情况。以CtDNA为模板，PCR法扩增Ahpc基因，将其克隆到pET28a载体。经鉴定后将其转化至表达菌E.coliBL21，利用IPTG诱导目的蛋白的表达。采用SDS-PAGE对表达产物进行分析并纯化重组Ahpc蛋白；采用氧化铁二甲酚橙法检测Ahpc蛋白的氢过氧化物酶活性。测定Ahpc蛋白表达的转基因菌和对照菌在百草枯胁迫下的生长曲线。结果：（1）荧光结果显示Ct感染能够诱

5、导巨噬细胞产生ROS，发现在3h时候其荧光值为1980±310，6h的荧光值为4260±350并且达到高峰，在9h时为2900±245，12h时为2100±250。（2）Ct感染过程中，Ahpc基因的表达上调，在3h时为初始的7.3倍，6h为初始的8.2倍，达到了高峰，然后开始下降，9h时为初始的5.2倍，12h为4.5倍。（3）成功扩增获得大小为588bp的Ahpc基因，所构建的原核重组质粒pET28a-Ahpc经PCR和测序鉴定与预期目的基因相符。（4）利用IPTG成功诱导Ahpc蛋白的表达，SDS结

6、果发现重组菌能够表达分子约为2+26kDa的蛋白质，并通过Ni亲和层析法纯化获得纯度较高的重组IAhpc蛋白。（5）Ahpc蛋白能够降解叔丁基过氧化氢（tert-butylhydroperoxide，t-BHP）和H2O2。（6）在百草枯引起的氧化应激条件下，转化pET28a-Ahpc表达载体的大肠杆菌生长要强于对照菌（转化了空载体pET28a）。结论：Ct感染会导致巨噬细胞产生氧化应激；Ahpc在Ct感染过程中表达上调；Ahpc蛋白具有氢过氧化物酶活性和能够赋予大肠杆菌抵抗氧化胁迫的能力。关键词：沙眼衣

7、原体；烷基氢过氧化物还原酶；活性氧；叔丁基过氧化氢IIProkaryoticexpressionandperoxidasesenzymeactivityofAhpcproteinfromC.trachomatisYangXiaochun(pathogenicbiology)DirectedbyliZhongyuAbstractObjective:TheaimofthisstudywastoinvestigatetheproductionofROSinmacrophagecellswhichwereinfe

8、ctedwithChlamydiatrachomatisandidentifytheantioxidantactivityofCtAhpcprotein.Methods:ThemacrophagecellswereinfectedwithCtandthecellswerecollectedat0h,3h,6h,9hand12h.Productionofreactiveoxygenspecies(ROS)wasdetectedb