异硫氰酸盐促进阿霉素诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

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1、＿广而科犬營＿２０１２１００３２Ｇｕａｎ学万：ｇｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ■博士学位论文异硫氰酸盐促进阿霉素诱导人骨肉瘤细胞调亡的实验研究范锲导师姓名：詹新立专业名称：脊柱骨病外科申请学位类型：学术型学位答辩委员会主席：金大地答辩委员会委员：李兆军肖增明肖绍文贺茂林二？一五年五月原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致，谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含获得广西

2、医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签签字日年月＆■＾６学位论文版权使用授权书丨本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定：。，即在校期间论文的知识产权属广西医科大学学校有权保存论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印或其它手段保存、：编本论文，学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同

3、媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定。．Ｊ学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年＆月ｌ日签字日期年月日｜目录１觀ＡＢＳＴＲＡＣＴ４ＩｔｆＷ８一－第部分阿霉素与异硫氰酸盐作用Ｕ２０Ｓ细胞调亡的检测１１１材料和方法１１２觀２５二－第部分异硫氰酸盐促进阿霉素诱导Ｕ２０Ｓ调亡的机制３６１材料与方法３６２贼４３職４９離５６献５６中英文缩写对照表６６６７献８３續９０异硫氰酸盐促进阿霄素诱导人骨肉瘤细胞调

4、亡的实验研究２０１２级博士学位论文摘要目的：本文旨在探讨异硫氰酸盐与阿霉素在体外联合作用人骨肉瘤细－－胞（Ｕ２０Ｓ）后对细胞凋亡的影响Ｕ２０Ｓ，证明异硫氰酸盐能促进阿霉素诱导细胞调亡一，并讨论其可能的作用机制，为骨肉瘤的临床治疗提供定的参考。＂方法：将冻存的Ｕ２０Ｓ细胞复苏培养后镜下观察拍照，了解细胞活性，并选取第二代生长良好的Ｕ－０Ｓｕｇ／ｍ２细胞作为实验对象；分别以ｌｌ、２．５ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、ｌＯｕｇ／ｍｌ、２５ｕｇ／ｍｌ浓度的阿霉素和２ｕＭ／ｍｌ，４ｕＭ／ｍｌ，８ｕＭ／ｍｌ，１６ｕＭ／ｍｌ，

5、３２ｕＭ／ｍｌ，６４ｕＭ／ｍｌ浓度的异硫氰酸盐单独Ｕ２－０Ｓ细胞作用于呈对数期生长的，检测药物对细胞增殖抑制率的影响，计算ＩＣ５０的数值；然后将ｌｕｇ／ｍｌ、３ｕｇ／ｍｌ、ｌＯｕｇ／ｍｌ的阿霉素分别与２ｕＭ／ｍｌ、２－．５ｕＭｌ、４ｕＭｌ、２０Ｓ细胞２４ｈ后／ｍ／ｍ的异硫氰酸盐联合作用于Ｕ，ＭＴＴ法进行细胞抑制率的测算，并绘制抑制率与浓度直方图，计算Ｑ值来评估两药联合作用的效应，得到最佳的药物作用浓度；根据最佳作用浓度，随机将细胞分为空白组、阿霉素组、异硫氰酸盐组及联合用药组四组，作用２４小时后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率

6、，比较各组细胞调亡率的变化情况；同样根据最佳作用浓度，以相同的分组方法检测ｃａｓｐａｓｅ３因子的活性情况及用ＴＵＮＥＬ试剂盒检测细胞凋亡，比较各组细胞调亡率的变化情况，并与流式细胞仪结果比较看变化的趋势是否一致；在作用机制的探讨中我们先－ＡＰ０－选用ＭＨ１芯片（细胞调亡抗体芯片）来检测相关的调亡因子，随机将培养好的细胞分为４组，分别为空白组、阿霉素组、异硫氰酸盐组及联合用药组，药物作用２４小时后用芯片检测约４０种较常见的细胞调亡因子，选取其中变化最大的因子作为我们下一步的研究对象，并了解他们之间的ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ

7、Ｃａｓｓｅ３ｃａｓｐａｓｅ９Ｂｅ－关系、＞１２；法检测四组细胞中ｐａ及Ｂａｘ的ｍＲＮＡ表达量，对比各组的结果；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测四组细胞中Ｉ异硫银酸盐促进阿霄素诱导人骨肉瘤细胞调亡的实验研究２０１２级博士学位论文Ｃａ－ｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ９、Ｂｃｌ２及Ｂａｘ蛋白表达量，比较各组之间的结果，并与细胞调亡抗体芯片及ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ的结果比较看因子的变化趋势是否一致。结果：复苏后的细胞按常规方法培养，二代细胞可在４８小时之内贴壁，细胞生长迅速，排列紧密，活性良好，可作为实验对象；Ｍ

8、ＴＴ法检测可知阿霉素和异硫氰酸盐药物浓度的增大，肿瘤细胞抑制率随之增高，阿霉