共表达gfp和猪egf重组嗜酸乳杆菌的构建及其生物学特性研究

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4、26B02）摘要本研究旨在利用pSET4s，通过基因同源重组技术，将外源基因猪表皮生长因子（EGF）和绿色荧光蛋白（GFP）整合到到嗜酸乳杆菌基因组中，通过抗性筛选与鉴定，获得能够稳定表达GFP和猪EGF的重组嗜酸乳杆菌，并对其进行生物学特性研究。试验一：pSET4s用于嗜酸乳杆菌基因重组可行性的分析（1）pSET4s电转化条件的优化试验表明，嗜酸乳杆菌培养过夜至OD600为0.6和终浓度为1.0%的甘氨酸LB培养基均有利于提高pSET4s质粒在嗜酸乳杆菌中转化效率。（2）pSET4s用于嗜酸乳杆菌基因重组可行性分析通过平板计数的方法对转入到嗜酸乳杆菌中的pSET4s进行28℃稳定性和37℃丢

5、失率的分析，结果发现其在28℃条件下能够稳定存在；在37℃时，培养16h后质粒完全丢失。因此pSET4s穿梭载体用于嗜酸乳杆菌的基因重组是可行的。试验二：共表达GFP和猪EGF重组嗜酸乳杆菌的构建通过PCR扩增获得嗜酸乳杆菌基因组中诱导表达位点和强启动子表达位点的上游同源臂P1、P3和下游同源臂P2、P4片段，将拼接正确的EGF基因和GFP基因与上下游同源臂及线性化的载体pSET4s进行连接，对重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，并命名pSET4s-P1-EGF+GFP-P2和pSET4s-P3-EGF+GFP-P4。将重组质粒分别电转化到嗜酸乳杆菌MG6243中，通过抗性和温度双重筛选得到重组

6、嗜酸乳杆菌，并通过PCR方法对重组嗜酸乳杆菌进行鉴定，并命名为ΔMG6243-1和ΔMG6243-2。试验三：重组嗜酸乳杆菌生物学特性研究（1）GFP和EGF在重组嗜酸乳杆菌的表达提取蛋白后，分别进行考马斯亮蓝染色和Westernblot分析，I结果表明重组菌具有分子量大小与理论相符的明显的差异蛋白条带，荧光显微镜观察重组菌具有绿色荧光；ELISA检测发现，重组菌能够稳定表达EGF，且浓度可以达到3.1ng/mL；表明表达GFP和EGF基因的重组嗜酸乳杆菌构建成功。（2）重组嗜酸乳杆菌的遗传稳定性分析传代10代后的重组菌仍然能扩增出目的基因条带和检测到绿色荧光，说明GFP基因能够在所构建的重组

7、菌中稳定遗传。（3）重组嗜酸乳杆菌的生长特性、酸碱盐的耐受性的研究通过平板计数的方法对重组菌的生长特性、酸碱盐的耐受性进行了研究，结果表明嗜酸乳杆菌与两株重组嗜酸乳杆菌相比，生长特性没有明显的变化，也都表现出一定的耐酸能力和胆盐耐受性。试验四：重组嗜酸乳杆菌对小鼠肠道作用的研究（1）选取6-8周龄体重约20g的雌性昆明小鼠，进行灌服试验，结果显示：与对照组相比，灌服嗜酸乳杆菌菌液降低了小鼠回肠隐窝