探索气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增

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1、大连理工大学硕士学位论文气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增姓名：朱琳申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：刘天庆20070620大连理工大学硕士学位论文摘要骨髓间充质干细胞(Mesenchymalsterncells，MSCs)不仅具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多个方向分化的潜能，还具有支持造血的重要功能，并且植入反应弱，易于被外源基因转染并稳定表达，是组织工程、细胞及基因治疗中理想的靶细胞。因此，MSCs正作为～种新型的“种子细胞”受到广泛关注。但是骨髓中的MSCs的含量非常少，仅占整个骨髓有核细胞

2、的1／20000～1／30000)并且随着个体年龄的增加，MSCs的数量逐渐减少、活性逐渐降低，很难满足自体修复和临床治疗的需求。已有的体外扩增方法存在着细胞扩增数量有限、细胞受到损伤较大、容易失去千细胞特性以及培养体系资源浪费等缺陷，达不到理想的培养效果。为了提高MSCs的扩增倍数并保持干细胞特征，本文采用气升式环流中空纤维膜生物反应器(a缸liftloophollowfibermembranebioreactor,ALI猢)进行体外扩增MSCs。将第四代骨髓间充质干细胞与含有bFGF的I型胶原溶液混合后接种于中空纤维膜内，置37℃、5％C02

3、、饱和湿度的C02培养箱孵育1小时后在膜内形成含有细胞的凝胶。然后将此中空纤维膜接种至气升式环流生物反应器(air-littloopbioreactor,ALB)内，加入含有bFGF的培养基，进行骨髓问充质干细胞三维动态培养与扩增。实验过程中每24小时取样测吸光度、计细胞数、绘制细胞生长曲线，测定细胞代谢参数，并对扩增的细胞进行流式细胞仪分析及多向诱导分化检测。结果表明，在ALHFMB内，02含量基本保持恒定；细胞代谢旺盛，MSCs扩增倍数明显增加，7天后接种密度为5X10scells／mL时MSCs扩增16倍，显著高于T—flask内近6倍的扩

4、增倍数；接种密度为l×105cells／mL时MSCs扩增37倍，显著高于T-flask内近12倍的扩增倍数；并且扩增的细胞仍能保持其自身表型并具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力。证明本文所采用的培养方法是体外培养与扩增MSCs的一种有效的方法。关键词：骨髓问充质干细胞；中空纤维膜；气升式环流生物反应器；凝胶；扩增气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增CultureandExpansionofMesenchymalStemCellsinAir-liftLoopHollowFiberMembraneBioreacto

5、rAbstractMesenchymalstemcells(MSCs)，havingthemulti-differentiationpotentialsofbecomingosteoblasts,chen&ocytcs，adipocytes，cadiocytesandSOon,axethepromising‘‘seedcells'’intissueengineeringandidealtargetcellsingenetherapyfortheirlowimplantingresponse,beingeasytobeuansfectexiande

6、xpressedsteadilyandfunctionofsupportingbematopoicsis．However,MSCs瓣inlirnitedquantityandonly1／20000～1／30000ofkaryocyt髂inbonemarrowandwhat’smore．thenumberdecreasesandviabilitylOSCSwithindividualageincreasing,which啪notmeettheneedofantologonsreFairation锄dclinicaltherapy．Withthepr

7、esentculturemethods。MSCsa碍inlimitedexpansionfoldandlosestemcellcharacterseasilybecauseofthecultureenvironmentfarawayfromtheinvivoconditions．Inordertosolvetheaboveproblems，here，柚air-liftloophollowfibermembranebi01"eflgtorwasdevelopedandusedtocultureandexpandMSCsinvitro．MSCsofp

8、assage4斜)mixedwith锣peIconagenwithbFGFwefeinueculate‘lintohoHowfiberm