生物反应器内培养兔骨髓间充质干细胞

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1、大连理工大学硕士学位论文生物反应器内培养兔骨髓间充质干细胞姓名：王艳芳申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：刘天庆20060601大连理工大学硕士学位论文摘要目的：建立兔骨髓问充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)体外分离培养的方法，并进一步研究其在旋转壁式生物反应器(rotatingⅣallvesselbioreactor，RWV)内结合微载体培养技术实现大规模培养的条件。方法：取3一14周龄的新西兰大白兔，分别采用全骨髓培养法和密度梯度离心法这两种方法在培养瓶中培养兔骨髓间充质于

2、细胞，并观察细胞形态特征、绘制生长鳇线、流式细胞仪检测细胞表面分子及向成骨细胞诱导；利用微载体培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增兔骨髓间充质干细胞，检测其组织形态及生物功能，并与静态培养作比较。结果：对于4—7周龄的新西兰大白兔，采用密度梯度离心法分离得到的骨髓间充质干细胞在4—7代时细胞形态好，增殖能力强，适合作进一步研究用。细胞接种密度为1×105cells／ml、Cytodex一3微载体浓度为lOmg／ml时，兔骨髓问充质干细胞在旋转壁式生物反应器中培养5天，细胞数达到最大。可扩增近lO倍，面应用微载体

3、技术在静态培养时只能扩增近4倍。同时对静态和动态培养的细胞进行形态、pH值、渗透压、葡萄糖、乳酸、流式检测及向成骨细胞诱导，发现旋转壁式生物反应器中培养兔骨髓间充质干细胞时，培养基的pH值在7．4—7．6之间，渗透压变化不大，与细胞在培养瓶中培养比较可见葡萄糖含量低而乳酸含量高。结论：采用密度梯度离心法成功建立了兔骨髓间充质干细胞体外分离培养体系，而新型旋转壁式生物反应器可以为骨髓间充质于细胞的体外大规模扩增提供理想的三维培养体系。关键词：骨髓问充质千细胞；微载体：旋转壁式生物反应器；免生物反应器内培养兔骨髓间充

4、质干细胞ExpansionofRabbitMesenchymalStemCellsinBioreactorAbstractObjective：Toestablishamethodtoisolateandculturetabbitbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro，andstudylarge-scaleexpansionofMSCsfromrabbitinrotatingwallvessel(RWV)bioreactor．Methods：Thera

5、bbitbonemarrow．derivedMSCswereculturedwithtwodifferentmethods--directeultureanddesitygradientcentrifogation．Thenthecellswereexaminedunderinvertedmicroscope，andthegrowthcuEvewasdrawl&viaCCK-8assay．A1SOCD44andCD45antigensweredetectedbyFCM，andtheosteogenicpotent

6、ialofthecellsWaSinvestigated．MSCswereexpandedinlargescaleinRWVbyusingmicrocarfierCytodex一3．西ehistomorphologyandbiologicalfunctionsoftheexpandedcellsinR孵werecomparedwiththoseinT．flasks．～Results：Fortherabbitsof4—7weeks，MSCsisolatedthrou曲densitygradiemcentrifuga

7、tionshowbettermorphologiesandhi曲erviability．Andthecellsproliferateinorerapidlyin4-7passage．WhentheinoculativedensityofMSCsis1×105ceU“mlandthemicrocarrierCytodex一3concentrationiS10mg／m1．MSCscultivatedinRWVforfivedaysCanexpandmorethanninetimesbutonlyfowtimesinT

8、—flaskinonegenera畦Oil．Moreover．thecultureparametersshOWthatthemediapHvallieinRWVis7．4—7．6．andtheglucosecontentiSlowerbuttheIacticacidcontentiShigherinRWVthallinT-flask．Conclusions：Density